Evaluación de la actividad anti-inflamatoria

El estudio de la actividad antiinflamatoria de los distintos compuestos fenólicos se llevó a cabo utilizando como biomarcador el factor transcripcional NF-kb, el cual se activa en caso de daño celular y traduce la señal provocando cambios a nivel celular y molecular, tales como el incremento de la citoquina TNF-α (Zhang et al. 2009). Para ello, se empleó la línea celular THP1- XBlue-CD14, derivada de monocitos humanos, en la que el gen de la fosfatasa alcalina se encuentra bajo el control del promotor de NF-kb. De esta manera, la cuantificación de la actividad fosfatasa alcalina se correlaciona con una inducción de la expresión de NF-kb y un incremento de la actividad anti-inflamatoria.

El diseño experimental se realizó considerando el efecto preventivo de los compuestos, incubando con los extractos primero, e induciendo posteriormente la estimulación del biomarcador NF-kb con lipopolisacárido (LPS). Paralelamente a la evaluación del efecto sobre la actividad de NF-kb se analizó la viabilidad celular mediante un ensayo de Alamar Blue para comprobar el estado de las células después del tratamiento con los extractos, siendo en todos los casos las células viables (datos no mostrados).

Los resultados pusieron de manifiesto un incremento significativo de la actividad de la fosfatasa alcalina en las células estimuladas con LPS en comparación con las no estimuladas (Figura 76). La dexametasona, utilizada como fármaco antiinflamatorio, y en este estudio como control positivo, redujo significativamente la actividad de la fosfatasa alcalina (p<0,001), tal como era de esperar. En la mayoría de los derivados del DHPG a concentraciones bajas se observó un leve incremento respecto al control en la actividad de la fosfatasa alcalina Aunque no era estadísticamente significativo, al observarse en todos los casos parece indicar una tendencia general. En el caso particular del derivado OPr Ac, este incremento es destacable, sugiriendo un papel pro-inflamatorio a concentraciones más bajas.

En líneas generales se apreció una correlación directa entre la longitud de la cadena alcoxi y la actividad antiinflamatoria, de manera que a medida que aumenta la longitud de la cadena se observan un efecto más pronunciado de la reducción de la actividad de la fosfatasa alcalina. Se observó también que, a concentraciones más elevadas, los valores de fosfatasa alcalina se redujeron significativamente en la mitad de los compuestos ensayados (DHPG, OEt Ac, OPr OH, OPr Ac, OBu OH, OBu Ac) y de acuerdo con ésto, la reducción fue más significativa en presencia de la dosis más alta utilizada. Otra observación interesante fue que los derivados acetilados muestran una mayor capacidad antiinflamatoria que sus correspondientes derivados no acetilados, en particular para los derivados de alcoxi de cadena intermedia (OEt y OPr).

Figura 76. Actividad anti-inflamatoria de los distintos compuestos fenólicos después de 2 h de incubación en monocitos humanos sometidos a 1 μg/ml LPS de lipopolisacárido de E. coli

0,1 1 10 50 100 200 0,1 1 10 50 100 200 0,1 1 10 50 100200 0,1 1 10 50 100 200

0,1 1 10 50 100 200 0,1 1 10 50 100 200 0,1 1 10 50 100200 0,1 1 10 50 100 200

0,1 1 10 50 100 200 0,1 1 10 50 100 200 0,1 1 10 50 100 200 0,1 1 10 50 100 200

(inflamación inducida), Todos los derivados fenólicos figuran junto al DHPG y el hidroxitirosol a efectos comparativos. Los datos se expresan como media ± desviación estándar de al menos 4 experimentos independientes. Las diferencias significativas con respecto al control del disolvente (DMSO 2%) usado como control negativo (Ctrl) se calcularon mediante ANOVA de un factor, seguido por LSD de Fisher (p <0.05), y se indican con asteriscos (* (p <0,05), ** (p <0,01) y *** (p <0,001)). Las diferencias significativas entre las concentraciones utilizadas. se calcularon usando la prueba t de Student y se están indicados con "a", "b" o “c”. T/C [%]: Total de fosfatasa

V.

DISCUSIÓN

Durante siglos, los microorganismos han sido utilizados en beneficio del hombre sin tener consciencia de que los productos obtenidos se debían a la función de enzimas producidas por éstos. No fue hasta 1876 cuando Kühne (Kühne 1976) definió por primera vez el término enzima, aunque no ha sido hasta años recientes cuando el término de biocatalizador ha cobrado importancia en disciplinas como química, biofísica, biología molecular y en el ámbito biotecnológico. El término biocatálisis hace referencia a la utilización de enzimas capaces de catalizar reacciones que conducen a la obtención de compuestos de interés. Hoy en día, la utilización de estas enzimas en procesos biotecnológicos está muy extendida y ha demostrado su eficacia, por ejemplo, en la síntesis de fármacos, herbicidas, en la producción de biocombustibles, o en la industria textil y de detergentes. Otro abordaje importante de la biocatálisis, y particularmente el uso de enzimas hidrolíticas como lipasas y esterasas, es constituir una alternativa a los métodos convencionales en síntesis química (Bouallagui et al. 2011; Adlercreutz 2013; Laszlo et al. 2013) ofreciendo la oportunidad de generar nuevos compuestos bioactivos mediante protecciones y desprotecciones estéreo- y regioselectivas de manera más eficiente (H-Kittikun et al. 2012).

La obtención de derivados lipofílicos de compuestos fenólicos, como el hidroxitirosol, mediante el uso de enzimas, ha sido ampliamente descrito en los últimos años (Grasso et al. 2007; Torres de Pinedo et al. 2007; Buisman et al. 1998). Estos compuestos fenólicos tienen una gran aplicación farmacéutica debido a que son los principales antioxidantes de la dieta. En las últimas décadas, diversos estudios epidemiológicos han puesto de manifiesto numerosos beneficios para la salud derivados del consumo de antioxidantes. Se ha observado que estos compuestos evitan daños producidos por estrés oxidativo en diferentes biomoléculas (ADN, lípidos, proteínas) previniendo, entre otros, el desarrollo de enfermedades degenerativas, cardiovasculares y cáncer (Cilla et al. 2009). En este contexto, está descrito que la protección y desprotección quimio-, regio- y estereoselectiva de grupos funcionales en compuestos fenólicos proporcionan a la molécula un aumento de la lipofília, aumentando su resistencia a la degradación metabólica. La obtención de estos derivados también se puede llevar a cabo mediante el uso de síntesis química convencional, pero supone enormes dificultades técnicas (Wuts et al. 2007; Kocienski 2005). Estas dificultades están relacionadas por ejemplo con la existencia de una alta densidad de grupos funcionales muy similares en las moléculas de interés, requiriendo así extensas secuencias de protección y desprotección hasta alcanzar la modificación deseada. Otro problema derivado es la necesidad de emplear reactivos peligrosos o condiciones dañinas para el medio ambiente que finalmente solo pueden ofrecer opciones limitadas.

V.1. SELECCIÓN Y OPTIMIZACIÓN DE CEPAS BACTERIANAS CON CAPACIDAD