Evaluación de la actividad de la enzima telomerasa

Se analizó la actividad de la enzima telomerasa en todos los cultivos celulares a las 18 horas, 10 días y 15 días luego de la exposición a BLM, EN y EZ y en los controles correspondientes (células no expuestas y células tratadas con citrato de sodio). Para ello, en el caso de la BLM y la EN, se utilizó el Kit TRAPeze-RT® (Telomeric repeat amplification protocol) (S7710) de detección de la telomerasa de la empresa Chemicon (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.); [103], [104] y la enzima ADN polimerasa Taq Platinum (Invitrogen, Grand Island, NY, EE.UU.), siguiendo el protocolo propuesto por el fabricante, detallado en el Anexo II (A5). Asimismo, para completar los datos obtenidos de actividad telomerásica, en las muestras tratadas con EZ (y sus respectivos controles), se utilizó el kit TRAPeze de detección de la telomerasa (S7700). El Kit TRAPeze-RT® (S7710) cuantifica la actividad de la enzima telomerasa a través de la medición de la emisión fluorescente en tiempo real mediante PCR cuantitativa (qPCR), mientras que con el kit TRAPeze (S7700), la actividad se determina mediante la amplificación de repetidos teloméricos por PCR convencional y el posterior análisis en geles de poliacrilamida. Si bien la sensibilidad de ésta metodología es mucho menor, se consideró la utilización de este kit (S7700) para poder concluir con los ensayos, ya que, al momento de realizar estos experimentos, el

kit anterior había dejado de fabricarse. En ambos casos, la actividad telomerásica se determinó a partir de extractos celulares provenientes de los cultivos sembrados en paralelo a los utilizados para el análisis citogenético.

El ensayo TRAP cuantifica la actividad de telomerasa en tejidos o extractos celulares mediante el agregado de repetidos teloméricos en el extremo 3′ de un oligómero. El producto obtenido sirve luego como templado para una reacción de PCR

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que permite medir el número de copias teloméricas resultantes de la actividad telomerásica celular.

La determinación de la actividad de la telomerasa se llevó a cabo a partir de los dos experimentos utilizados en el estudio citogenético de células tratadas con BLM, EN y EZ. Las reacciones de qPCR (BLM y EN) y de PCR convencional (EZ) se corrieron por duplicado. Los extractos celulares que se utilizaron en los ensayos fueron tomados a las 18 horas, 10 días y 15 días luego del tratamiento con BLM, EN y EZ y a partir de los controles correspondientes (células sin exponer y con el buffer citrato de sodio). Los extractos celulares fueron resuspendidos en 100 μl de buffer de lisis CHAPS, detergente con alta capacidad de disolución de la membrana, que permite mantener la conformación de la proteína y la interacción proteína-proteína. El buffer de lisis CHAPS proporciona el medio adecuado para la lisis celular y la extracción proteica.

La concentración de proteínas se determinó utilizando el Quant-iT Protein Assay Kit con el Qubit Fluorometer (Invitrogen, Grand Island, NY), siguiendo el protocolo indicado por el proveedor; descripto en el Anexo II (A6). Los ensayos de actividad de la telomerasa se realizaron a partir de 1,5 μg/ul de proteína. Para el caso de la BLM y la EN, se generó una curva standard a partir de las mediciones de las reacciones llevadas a cabo con el templado control TRS8 incluido en el Kit TRAPeze- RT® (S7710). Los controles positivos y negativos fueron analizados en referencia a la curva standard. La actividad de la enzima telomerasa (el total de producto generado o TPG) fue calculada comparando el valor promedio de los Ct obtenidos en cada reacción por duplicado con los valores de Ct obtenidos con el templado control TSR8 en la curva standard. Las reacciones se llevaron cabo en el equipo ABI Prism 7500 (Bio-Rad Laboratories Inc., Irvine, CA). Las condiciones de ciclado fueron un ciclo de 30°C durante 30 min y un ciclo de 95°C durante 2 mi n, seguidos por 45 ciclos de 94°C por 15 seg, 59°C por 60 seg y 45°C durante 10 seg.

Como se mencionó anteriormente, para el caso de las muestras tratadas con EZ y sus respectivos controles, se utilizó el kit TRAPeze (S7700). En este caso, la reacción de PCR se realizó según el protocolo detallado por el proveedor, realizando una incubación durante 30 minutos a 37°C, seguida p or 33 ciclos de 94°C durante 30 seg, 59°C por 30 seg y 72°C durante 1 min. Los prod uctos de amplificación se detectaron mediante electroforesis en geles de acrilamida al 12% en buffer TBE 1X. Además de las muestras, se sembraron dos marcadores de tamaño molecular de 100pb y 25 pb Ladder (Invitrogen, Grand Island, NY). Los geles se visualizaron

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mediante la tinción del gel con GelRed (Biotium, California) y se fotografiaron usando un sistema de documentación de geles Molecular Imager® Gbox XRTM (Bio-rad Laboratories Inc., Irvine, CA). El análisis cuantitativo de los geles se llevó a cabo utilizando el programa de acceso gratuito ImageJ para Windows (Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA). En todos los casos, los ensayos se realizaron por duplicado y se calculó el Total de Producto Generado promedio (TPG o Total Product Generated), con la siguiente fórmula, siguiendo las indicaciones del proveedor:

TPG (Unidades) = (X-X0)/C (r-r0)/CR

X: Señal de la muestra.

X0: Señal de la muestra incubada a 85°C para inactiva r la actividad de la enzima. C: Señal del control interno standard de 36 pb incluido en el kit s7700 presente en las muestras sin incubación a 85°C.

r: Señal del control de cuantificación TSR8, incluido en el kit s7700. r0: Señal del control negativo sin muestra

CR: Señal del control interno standard de 36pb presente en la muestra de TSR8 incluida en el kit s7700.

4.1.3.1 Análisis estadístico de los datos de actividad telomerásica

Se realizó el análisis estadístico de los datos utilizando el programa Graphpad Prism versión 5.0 para Windows (GraphPad Software, San Diego, CA). Para determinar la significancia estadística de las diferencias observadas en la actividad de la enzima telomerasa entre las células ADIPO-P2 tratadas con los mutágenos químicos (BLM y EN) y sus controles correspondientes, se utilizó ANOVA de una sola vía con el test de Kruskal-Wallis. Se consideraron diferencias estadísticamente significativas aquellas con un valor de p<0.05. En el caso de los datos obtenidos de la EZ (utilizando el kit TRAPeze de detección de la telomerasa (S7700), se realizó el análisis cuantitativo de los geles de poliacrilamida obtenidos y los datos fueron analizados según la metodología detallada por el proveedor, descripta en la sección 4.1.3.

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