Evaluación de la actividad Polifenoloxidasa (PFO; E.C 1.14.18.1)

En la figuras 23 y 24 se ilustra la actividad PFO registrada para las dos variedades de fresa estudiadas: Chandler (S) y Sweet Charlie (T) expuestas a 4ºC y -2ºC por 30 y 60 minutos –para cada temperatura- y sus respectivos controles (plantas mantenidas a temperatura ambiente). Además, se incluye la actividad enzimática PFO registrada en plantas de las mismas variedades, que fueron previamente aclimatadas como ya se describió y expuestas a -2ºC por 30 y 60 minutos. La actividad enzimática se determinó a los 10, 30 y 60 minutos (tiempo postratamiento) después de cada tiempo de exposición para todos los tratamientos aplicados.

Figura 23. Actividad PFO. Plantas de fresa variedad Chandler (Susceptible) y variedad Sweet Charlie (Tolerante) expuestas a 4ºC y -2ºC por 30min y las mismas variedades aclimatadas con posterior exposición a -2ºC por 30min.

A ctividad P F O - P lantas var. C handler (S) y Sweet C harlie (T ) expuestas a 4ºC y -2ºC po r 30min y las mismas variedades aclimatadas (30 M in a -2ºC )

70 90 110 130 150 170 190 210 230 10 30 60

T iempo po stratamiento (minuto s)

∆ Ab s m in -1 mg de pr o t -1

var S (Co ntro l) var S (4ºC) var S (-2ºC) var S (A climatadas)

Figura 24. Actividad PFO. Plantas de fresa variedad Chandler (Susceptible) y variedad Sweet Charlie (Tolerante) expuestas a 4ºC y -2ºC por 60min y las mismas variedades aclimatadas con posterior exposición a -2ºC por 60min.

Como se puede observar en las figuras 23 y 24, los niveles constitutivos de actividad PFO, fueron significativamente más altos en la variedad Sweet Charlie (T) que en la variedad Chandler (S). Los niveles constitutivos de actividad PFO (al igual que de POX) son por lo general más altos en cultivares resistentes a enfermedades fúngicas que en cultivares susceptibles, lo que ha sido reportado dentro del contexto biótico en diversas interacciones hospedero - patógeno: Clavel (Dianthus caryophillus) - Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2; tomate (Lycopersicum esculentum) – Pseudomonas syringae y tabaco (Nicotiana tabacum) – virus del mosaico, ñame (Dioscorea alata TDA) – Colletotrichum gloeosporioides, entre otros (Bell, 1981; Steffens, 2000; Ardila, 2005; Cerón, 2005). Como se mencionó anteriormente, la variedad Sweet Charlie (T) es resistente a la antracnosis y además presenta una tolerancia constitutiva al estrés por frío, lo que puede indicar que esta última característica está relacionada con niveles mas altos de PFO en plantas control.

A ctividad P F O - P lantas var. C handler (S ) y Sweet C harlie (T ) expuestas a 4ºC y -2ºC po r 60min y las mismas variedades aclimatadas (60 M in a -2ºC )

50 70 90 110 130 150 170 190 210 10 30 60

T iempo po stratamiento (minuto s)

∆ Ab s mi n -1 m g de pr ot -1

var S (Co ntro l) var S (4ºC) var S (-2ºC) var S (A climatadas)

Al inducir choques térmicos (por bajas temperaturas) en las dos variedades de fresa en estudio, se observó que la actividad PFO fue significativamente menor en todos los tratamientos aplicados a la variedad susceptible, con respecto a todos los tratamientos aplicados a la variedad tolerante. La actividad determinada en las plantas de la variedad S expuestas a 4ºC y -2ºC por 30 minutos, fue significativamente menor respecto a su control (S), disminución que también se presentó a los 60 minutos de exposición a las mismas temperaturas frente a su control. A diferencia de lo encontrado para la actividad enzimática POX, el factor tiempo de exposición (30 y 60 minutos) tuvo un efecto significativo sobre la actividad PFO: se encontraron valores más bajos de actividad cuando las plantas fueron expuestas a 4ºC y a -2ºC por 60 minutos, que cuando las plantas fueron expuestas a las mismas temperaturas por 30 minutos. Así mismo, hubo diferencias significativas entre las dos temperaturas empleadas, registrando los valores más bajos de actividad a -2ºC. Lo anterior puede indicar que la enzima PFO es más sensible a la exposición a bajas temperaturas durante períodos cortos, que la enzima POX.

En cuanto a los niveles de actividad polifenoloxidasa registrados en plantas de la variedad T expuestas a los mismos tratamientos, se observó la misma disminución significativa frente a sus respectivos controles.

Dentro de cada uno de los tratamientos, para las dos variedades de fresa, no hubo diferencias significativas de actividad a través del tiempo (10, 30 y 60 minutos).

Gechev et al. 2003, reportaron que algunas enzimas relacionadas con la respuesta de las plantas al estrés por frío, pueden operar de manera diferente y verse mas afectadas que otras, siendo factores débiles en la protección celular contra este tipo de estrés. En este sentido, el autor señaló que plantas de tabaco (Nicotiana tabacum, cv. Petit Havana SR1) expuestas a bajas temperaturas, incrementaron los niveles de actividad peroxidasa, ascorbato peroxidasa y superoxido dismutasa y, disminuyeron los niveles de actividad catalasa, polifenoloxidasa y dehidroascorbato reductasa. Los niveles de actividad catalasa y PFO mostraron una disminución más

rápida en respuesta a la exposición a bajas temperaturas, siendo éstas las más afectadas por este tipo de estrés.

Por otra parte, es conocido que la actividad polifenoloxidasa está implicada en múltiples funciones del desarrollo normal de las plantas así como en las respuestas vegetales a diferentes tipos de estrés biótico y abiótico (Constabel et al. 1998). Un incremento en los niveles de esta enzima ha sido reportado en plantas de

Arabidopsis thaliana, en respuesta al estrés por bajas temperaturas (Leyva et al. 1995) y en hojas de papa (Solanum tuberosum) en respuesta a la inducción mecánica de heridas (Thipyapong et al. 1995). En contraste a lo reportado por estos autores, los experimentos del presente trabajo mostraron que plantas de fresa variedad Chandler (S) y Sweet Charlie (T) disminuyeron los niveles de actividad PFO en respuesta al estrés por frío. Según la literatura consultada, lo anterior ha sido reportado por muy pocos autores y ha sido relacionado - como se mencionó para la actividad POX - con la acumulación de compuestos fenólicos (Rivero et al. 2001; Gechev et al. 2003).

Rivero et al. 2001, reportaron en plantas de tomate (Lycopersicon esculentum L. cv Tmknvf2) sometidas a estrés por altas temperaturas y en plantas de sandía (Citrullus lanatus [Thomb.] Mansf. cv. Dulce Maravilla) sometidas a bajas temperaturas, una disminución de la actividad POX y PFO, y un incremento de la actividad fenilalanina amonioliasa (PAL) y del contenido de compuestos fenólicos.

Varios autores han reportado que condiciones de estrés tales como exceso de luz, bajas temperaturas, radiación UV y ataque de patógenos, estimula la producción de compuestos fenólicos, los cuales, hacen parte del sistema antioxidante de las plantas para prevenir la acumulación de especies reactivas de oxígeno (EORs) (Pennycooke et al. 2005). Como se mencionó en el marco teórico, aunque las EROs están presentes en las plantas a varios niveles como resultado del metabolismo aeróbico normal, incluyendo los sistemas transportadores de electrones en los cloroplastos, mitocondria y membrana plasmática (Kuk, 2003), la imposición de condiciones de estrés bióticas y abióticas incrementan la concentración de estas

especies, resultando en daño oxidativo a nivel celular, por su alta reacción con moléculas orgánicas.

En las plantas, el metabolismo de los compuestos fenólicos es regulado por la actividad de varias enzimas. La fenilalanina amonioliasa (PAL) es considerada la principal enzima de la vía fenilpropanoide, catalizando la transformación por deaminación, de L-fenilalanina en ácido trans cináminco, el cual, es el principal intermediario en la biosíntesis de compuestos fenólicos (Rivero et al. 2001). Mediante esta vía metabólica se sintetizan compuestos como la lignina, suberina, fitoalexinas, flavonoides, antocianinas y compuestos fenólicos en general, que desempeñan funciones fisiológicas y ecológicas importantes en las plantas tales como: rizogénesis, vitrificación, resistencia a diferentes tipos de estrés, participación en reacciones de oxido-reducción, inhibición del crecimiento de plantas vecinas, atracción de insectos polinizadores, entre otras (Ruiz, et al. 1999). Así mismo, se ha reportado las propiedades antioxidantes de algunos compuestos fenólicos; por ejemplo, el ácido clorogénico, un antioxidante de la vía fenilpropanoide, inhibe la formación de radicales libres como aniones superóxido y su acumulación ha sido detectada en plantas de Mahonia repens en respuesta a una combinación de factores estresantes: exposición a bajas temperaturas y alta radiación solar (Grace et al.1998). Los flavonoides tienen una estructura química adecuada para actuar como antioxidantes: pueden donar hidrógenos, o electrones a los radicales libres o bien atraparlos y desplazados en su estructura aromática y, su acumulación también ha sido reportada en varias especies vegetales en respuesta a diferentes tipos de estrés: pino (Pinus banksiana) en respuesta a la infección por patógenos (Nozolillo et al. 1990), maíz (Zea mays) en respuesta a las bajas temperaturas (Christie et al. 1994) y mutantes de Arabidopisis en respuesta a la radiación UV (Bharti et al. 1997).

Enzimas como la POX y la PFO también desempeñan un papel importante en el metabolismo de compuestos fenólicos, ya que, catalizan la oxidación de fenoles a quinonas. Bajo estrés, enzimas como la PAL, pueden ser activadas y enzimas como la POX y la PFO –que oxidan compuestos fenólicos- inhibidas. Por consiguiente, la acumulación de compuestos fenólicos y el incremento de la actividad PAL, puede verse como un mecanismo de las plantas contra el estrés térmico (Rivero et al.

2001), y pudo ser el empleado por las dos variedades de fresa estudiadas contra la exposición a bajas temperaturas.

Plantas de la variedad S que fueron previamente aclimatadas como ya se describió (sección 5.1) con posterior exposición a -2ºC por 30 y 60 minutos, presentaron diferencias significativas de actividad frente a su respectivo tratamiento control. Así mismo, en plantas de la variedad S no se observó el efecto de la aclimatación, ya que no hubo diferencias significativas de actividad PFO entre las plantas aclimatadas y las plantas no aclimatadas de la misma variedad expuestas a -2ºC por 30 y 60 minutos. Lo anterior indica que la PFO responde de manera diferente a la actividad POX al proceso de aclimatación en plantas de la variedad S, y puede no ser un factor importante en el incremento de la tolerancia al estrés por frío (aclimatación) en esta variedad de fresa (Figura 25).

Figura 25. Actividad PFO. Plantas de fresa variedad Chandler (Susceptible) aclimatadas y no aclimatadas expuestas a -2ºC por 60 minutos, a los 10 minutos después del tiempo de exposición.

Por otra parte, las plantas aclimatadas de la variedad T no presentaron diferencias significativas cuando fueron expuestas a -2ºC por 30 y 60 minutos frente a su respectivo tratamiento control, siendo esta la misma respuesta que se registró para la actividad POX.

A continuación, se ilustra la actividad PFO registrada para la variedad susceptible y para la variedad tolerante, luego de ser expuestas a 4ºC y -2ºC por ocho días (T17 a T22) para cada temperatura. La actividad se determinó cada dos días (tiempo postratamiento) durante el tiempo de exposición para todos los tratamientos aplicados. Figuras 26, 27 y 28.

Figura 26. Actividad PFO. Plantas de fresa Fragaria x ananassa variedad Chandler (S) expuestas a 4ºC y -2ºC por ocho días.

Figura 27. Actividad PFO. Plantas Fragaria x ananassa variedad Sweet Charlie (T) expuestas a 4ºC y -2ºC por ocho días.

A ct ivid ad PF O. Plant as varied ad C hand ler ( S) exp uest as a 4 º C y - 2 º C p o r o cho d í as.

40 60 80 100 120 140 160 180 200 2 4 6 8

T iemp o p o st rat amient o ( d í as)

∆ Ab s m in -1 mg de pr ot -1

var S (Control) var S (4ºC) var S (-2ºC)

A ct ivid ad PF O. Plant as varied ad Sweet C harlie ( T ) exp uest as a 4 º C y - 2 º C p o r o cho d í as. 80 100 120 140 160 180 200 220 2 4 6 8

T iemp o p o st rt amient o ( d í as)

∆ Ab s mi n -1 m g de pr ot -1

A ctividad P F O - P lantas var. C handler (S) y Sweet C harlie (T ) expuestas a 4ºC y -2ºC po r o cho dí as. 40 80 120 160 200 2 4 6 8

T iempo po stratamiento (dí as)

∆ Ab s m in -1 mg de pr ot -1

var S (Co ntro l) var S (4ºC) var S (-2ºC)

var T (Co ntro l) var T (4ºC) var T (-2ºC)

Figura 28. Actividad PFO. Plantas de fresa Fragaria x ananassa variedad Chandler (S) y Sweet Charlie (T) expuestas a 4ºC y -2ºC por ocho días.

Como se puede observar en las figuras 26, 27 y 28, los niveles de actividad PFO en la variedad susceptible, tanto de plantas control, como expuestas a bajas temperaturas (4ºC y -2ºC) por ocho días, fueron significativamente menores con respecto a los mismos encontrados en la variedad tolerante.

En general, la actividad PFO de la variedad susceptible expuesta a 4ºC y a -2ºC durante los ocho días que duró el experimento, fue significativamente menor (alrededor de 3 veces) frente a su tratamiento control S. Los niveles de actividad en la variedad tolerante también disminuyeron significativamente (alrededor de 1.6 veces) respecto a su control (T) cuando las plantas se expusieron a los mismos tratamientos con bajas temperaturas. Hubo diferencias significativas entre las dos temperaturas empleadas y el tratamiento control (T), registrando valores más bajos de actividad a -2ºC.

Cabe mencionar, que la disminución de actividad para las dos temperaturas (4ºC y -2ºC) y para las dos variedades estudiadas, se observó de manera progresiva desde el segundo día hasta el octavo día de exposición.

En general, los resultados obtenidos en términos de las dos actividades enzimáticas evaluadas (POX – PFO), indican que las plantas de fresa tanto de la variedad susceptible como de la variedad tolerante, emplearon mecanismos diferentes al incremento de estas enzimas, para proteger los componentes celulares del daño oxidativo causado por la explosión de EORs y, que la actividad PFO es más sensible al estrés por bajas temperaturas durante períodos cortos de exposición que la actividad POX. Sin embargo, para asegurar que una de las estrategias que emplean las dos variedades de fresa en respuesta al estrés por bajas temperaturas, es la acumulación de compuestos fenólicos, sería necesario realizar estudios complementarios donde se determine la actividad PAL y el contenido y caracterización de compuestos fenólicos, en las dos variedades de fresa estudiadas en el presente trabajo, bajo condiciones similares de estrés por bajas temperaturas.

Además, una disminución mayor de las dos actividades enzimáticas (POX y PFO) registrada en todos los tratamientos aplicados con bajas temperaturas, durante períodos cortos y prolongados de exposición en la variedad S, indica que esta variedad experimenta más daños a nivel celular que la variedad T, ya que no posee mecanismos constitutivos que la protejan de los daños ocasionados por este tipo de estrés