4. Generación de un equivalente dérmico usando fibroblastos cultivados sobre
4.2 Resultados y discusión
4.2.5 Evaluación de la proliferación en biorreactor
La evaluación de la proliferación celular en reactor spinner se presenta en la Figura 4-7, comparada con la proliferación celular en caja de microtécnica, para los fibroblastos humanos. Como se puede ver en la mencionada figura, no se presenta una fase de latencia en el crecimiento en biorreactor, sino que las células empiezan a proliferar sobre la superficie disponible del microportador. El tiempo de duplicación para el reactor spinner calculado a partir de los datos presentados fue 28.43 ± 2.09 h, el cual resulta menor al obtenido para las células cultivadas en caja de cultivo el que fue de 37.5 ± 1.28 h. El tiempo de duplicación es del mismo orden que el reportado por Phillips et al [179], quienes reportan un tiempo de duplicación de 22.5 h para el cultivo de fibroblastos humanos sobre microportadores de poliestireno recubierto con trimetil amonio.
Tiempo (h) 0 20 40 60 80 100 120 Con cen tr ació n celu la r (célu la s/p oz o) 1e+4 1e+5
Figura 4-7: Cinética de crecimiento de fibroblastos humanos en reactor spinner. A: reactor spinner con una concentración inicial de microportadores de 20,000 microportadores/ml. B: en caja de microtécnica. El tiempo de duplicación en reactor spinner fue de 28.43 ± 2.09 h, menor al obtenido en la caja de microtécnica 37.5 ± 1.28 h.
La adhesión de los fibroblastos humanos a los microportadores se debe a la presencia de integrinas αvβ3 en la membrana celular, las cuales se unen a los sitios RGD presentes en la fibrina [191]. La cinética de crecimiento muestra que no existe fase de latencia, lo cual puede ser comparado con la cinética de crecimiento realizada para las células murinas (Figura 3-18), lo anterior se debe a una mayor interrelación entre la fibrina humana y los fibroblastos humanos.
La proliferación en biorreactor permitió incrementar la concentración celular cerca de 3 veces, a pasar de una concentración inicial de 1X105 a 3 X 105 en 72 horas. La
concentración celular en reactores spinner se puede incrementar mucho más al colocar una mayor concentración de microportadores inicial; sin embargo, en este estudio se buscó realizar la exploración de la proliferación celular en reactor spinner, la información obtenida permitiría realizar el escalamiento del proceso a un mayor volumen y con mayor concentración de microportadores. La Figura 4-8 (B) muestra una fotografía obtenida mediante microscopía de barrido electrónico (SEM), para los microportadores cargados con fibroblastos a la hora 48 de cultivo. Debido al procesamiento de entrecruzamiento con glutaraldehído y deshidratación con etanol, se presenta deformación del microportador por lo que no se pueden identificar plenamente los fibroblastos, al comparar la mencionada fotografía con la Figura 4-8 (A). Por ello se concluye que la mejor alternativa para la
Tiempo (h) 0 20 40 60 80 Concen tración celu lar (c élu las/ m l) 1,0e+5 1,5e+5 2,0e+5 2,5e+5 3,0e+5 3,5e+5 A B
obtención de fotografías de las células sobre los microportadores es mediante la tinción con agentes fluorescentes y el uso de microscopía confocal o de fluorescencia (Figura 3-19 y Figura 3-20).
Grandes ventajas se pueden tener al cultivar fibroblastos sobre microportadores. Por ejemplo, Palmiero et al [149] reportan, después de 4 días de cultivo en reactor spinner, la formación de colágeno tipo I para el cultivo de fibroblastos bovinos al ser cultivados en microportadores de gelatina, comparados con el cultivo en 2D sobre frascos de cultivo. Lo anterior se debe fundamentalmente a que las células son cultivadas en 3D y por otro lado, la aplicación de esfuerzos cortantes durante la agitación favorece la expresión de colágeno.
Aunque el uso de microportadores y biorreactores ha sido empleado desde hace varios años para la producción de hibridomas, vacunas y factores de crecimiento, la posibilidad de usar este tipo de tecnología para el cultivo de aislamientos primarios emerge como una posibilidad a integrar en la Ingeniería Tisular [179].
Figura 4-8: Microscopía electrónica de barrido (SEM) para microportadores. A: microportadores sin fibroblastos; B: microportadores con fibroblastos adheridos. Debido al tratamiento de entrecruzamiento y deshidratación con glutaraldehído y etanol, se presenta deformación de los microportadores
Una de las ventajas de usar células adheridas a microportadores está relacionada con la posibilidad de transportarlas desde el laboratorio hasta la clínica. Gorodetsky et al [192] evaluaron la posibilidad de mantener fibroblastos adheridos a microportadores de fibrina en condiciones de hipoxia a temperatura ambiente, y encontraron que es posible extender hasta por 10 días las células viables y adheridas, lo cual se convierte en una alternativa tecnológica para el traslado de equivalentes.
Adicionalmente, los fibroblastos adheridos sobre microportadores pueden ser aplicados directamente en la zona de la herida. En esta vía Lafrance y Armstrong [133] emplearon microesferas (diámetro: 73-140m) de PLGA sobre las cuales crecieron fibroblastos y queratinocitos y los colocaron en zonas afectadas de modelos porcinos y encontraron que la cicatrización es más rápida y natural frente a otros métodos, además estimaron que con 2 g de microportadores podrían cubrir un área cercana a 2 m2 que es la superficie total del
cuerpo. Una de las desventajas de este material es la pérdida de la capacidad de controlar la pérdida de fluidos de la superficie de la herida, y de proveer una barrera a la infección. En esta vía la aplicación de microportadores y biorreactores puede contribuir con la reparación y remodelación tisular que iría más allá a ser un método de proliferación celular.
Otra posibilidad es el atrapamiento de los microportadores cargados con fibroblastos en geles. Esta vía ha sido explorada por Nehls y Drenckhahn [137] quienes muestran que células endoteliales adheridas a microportadores al ser colocados en geles de fibrina presentan migración celular y favorecen la angiogénesis. Sommar et al. [150] realizan el cultivo de fibroblastos humanos sobre microportadores de gelatina, los cuales son atrapados en geles de plasma rico en plaquetas, y mediante el empleo de medios inductores logran la formación de cartílago y hueso in vitro. Esta alternativa no se evaluó en este trabajo porque se prefirió el cultivo convencional en geles con células atrapadas en ellos.