EVALUACIÓN DE SU ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL ACEITE

ESENCIAL DE Luma chequen (Molina) A. Gray “ARRAYÁN”

El método de difusión en agar, está apoyado por datos clínicos y de laboratorios; presenta la ventaja de sus resultados son altamente reproducibles. La técnica está basada en el método originalmente descrito por Bauer (Método de Kirby – Bauer). Este método de difusión en disco o pozo fue estandarizado y es actualmente recomendado por el subcomité de Ensayos de Susceptibilidad (NCCLS, 2001).

Las metodologías aplicadas siempre consideran la estandarización de la concentración bacteriana a utilizar, con el ánimo de evitar un crecimiento exhaustivo el cual puede variar significativamente la respuesta del extracto vegetal o aceite esencial, indicando la necesidad de utilizar concentraciones mayores de éste para inhibir el crecimiento del microorganismo. La concentración de bacterias usada para estudio de susceptibilidad en el laboratorio ha sido estandarizada, a un patrón de 0,5 equivalente a 1,5 x 108 (UFC) mL en la escala de Mac Farland.

32 Es recomendable tomar el inóculo de cultivos en la fase de crecimiento y siempre tomar 4 o 5 colonias de un cultivo puro para evitar seleccionar variantes atípicas (Hernández, 2003).

Los medios de cultivo más utilizados son el Agar Mueller Hinton y Agar Tripticasa Soya, ya que sus componentes facilitan el crecimiento de diferentes cepas bacterianas (ver tabla 1) y mayor difusión de las muestras (Winn et al., 2008).

El método para determinar la actividad antibacteriana de inhibición del aceite del Arrayan es Bauer – Kirby de discos o pozos, la respuesta de los microorganismos a diferentes concentraciones del aceite del Arrayan de acuerdo al halo de inhibición que presentan las bacterias. Se aplicó la técnica en medio líquido para observar cual es la concentración mínima inhibidora (CMI) del aceite de Arrayán para inhabilitar el crecimiento de las bacterias (Álvarez et al., 2005; Udaya y Hazzena, 2002; Gutiérrez, 2002).

Tabla 1.- Bacterias utilizadas en el estudio de la actividad antibacteriana del aceite esencial de Luma chequen (Molina) A. Gray “Arrayán”

Nombre Gram Familia

Escherichia coli TCC25922 ATCC 25922 (–) Enterobacteriaceae

Staphylococcus aureus ATCC 25923 (+) Micrococaceae

33 CAPITULO II

METODOLOGÍA

EXTRACCIÓN, PURIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE SU ACTIVIDAD

ANTIBACTERIANA DEL ACEITE ESENCIAL DE Luma chequen (Molina) A. Gray “ARRAYÁN”.

En la presente investigación se utilizó el aceite esencial de Luma chequen (Molina) A. Gray “Arrayán” extraído por el método de destilación por arrastre con vapor de agua (Ver figura 28).

Las muestras fueron recolectadas en el campus de la Universidad Nacional de San Agustín de Arequipa, el proceso de extracción se realizó en el laboratorio de Química Orgánica del Departamento de Química por el método de la destilación por arrastre con vapor de agua y se realizó los análisis físico – químicos.

La Espectroscopia Infrarroja (IR), se realizó en el laboratorio de Química Analítica, la evaluación de la actividad antibacteriana en el laboratorio de Química Orgánica del Departamento Académico de Química de la Universidad Nacional de San Agustín de Arequipa, la Espectroscopia ultravioleta (UV – VIS), se realizó en la Universidad Católica Santa María de Arequipa y la determinación de cromatografía de gases acoplada a Espectrofotometría de masas (GC – MS), se realizó en la Universidad Nacional de San Antonio de Abad del Cusco.

2.1. MATERIALES Y REACTIVOS

34 Considerando las formas de su uso tradicional se investigaron las hojas y flores de Luma chequen (Molina) A. Gray “Arrayán” previamente identificada y recolectada en la ciudad de Arequipa.

Figura 28.- Plantas con hojas y flores de Luma chequen (Molina) A. Gray “Arrayán”

2.1.2. Material y reactivos

Material de vidrio y otros

- Picnómetro - Bureta - Matraz - Matraz Erlenmeyer - Luna de reloj - Desecador - Vaso de precipitados - Tubos de ensayos - Micropipeta

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- Pipeta

- Vaso de precipitados Reactivos

- Etanol (C2H5OH) al 95% p.a. Merck S.A.

- Agua destilada (H2O)

- Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4) p.a. Merck S.A

Equipos

- Estufa

- Balanza analítica Sartorius ± 0,0001

- Equipo de destilación por arrastre con vapor de agua.

- Refractómetro de Abbe (Sprzet RI – 1)

- Cromatografía de Gases acoplado a espectrometría de masas (GC-GM) Agilent 6890N.

- Espectrofotómetro UV VIS (NM MAX/UABS)

- Espectrofotómetro infrarrojo (IR) Thermo Nicolet iS50 FTIR

- Polarímetro

- Cámara Frigorífica

- Campana de esterilización de luz UV – VIS

2.2. MUESTREO

Para la presente investigación, se empleó como material biológico, la parte aérea de Luma chequen (Molina) A. Gray “Arrayán” previamente identificada, se recolecto en los jardines de la Universidad Nacional de San Agustín del departamento de Arequipa durante los meses de julio - enero del año 2017 (figura 29).

36 En la recolección de la muestra se consideró los aspectos como: clima, horario de recolección, estado vegetativo de floración, periodo de crecimiento del estado foliar, cantidad de recolección, almacenamiento, lugar de muestreo, fecha de muestreo altitud, eficiencia de temperatura, humedad atmosférica, precipitación, topografía, suelo, tipo de vegetación y plantas dominantes en el área (ver tabla 2).

Todo el material vegetal fue recolectado de siete a diez de la mañana; para la elección del lugar, se consideró la abundancia de la materia prima, para la selección de la parte aérea (tallos, hojas y flores) (ver figura 29). Se tomó en cuenta las características morfológicas y botánicas, el material biológico debe ser sano libre de impurezas e insecticidas y se almaceno en bolsas de papel para su posterior utilización; para la identificación botánica fueron utilizados diez arbustos de la especie y luego se llevó a la Escuela profesional de Biología de la Universidad Nacional de San Agustín.

Figura 29.- Muestreo de Luma chequen (Molina) A. Gray “Arrayán”

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Aspecto de muestreo Datos de muestreo

Clima Día despejado no lluvioso

Horario Recolección de siete a diez de la mañana

Estado vegetativo En estado de floración

Periodo de crecimiento Estado foliar

Cantidad 10 kilos material fresco

Almacenamiento Bolsas de papel y cajas de tecnopor debidamente

rotuladas

Lugar de muestreo Departamento, provincia y distrito de Arequipa

Fecha de muestreo Durante los meses de setiembre - enero

Altitud 2400 msnm

Humedad atmosférica 20%

Precipitación Escasa

Suelo Superficial arenoso

Tipo de vegetación Cultivada

Plantas dominantes Luma chequen (Molina) A. Gray “Arrayán” (40) Fuente: elaboración propia

2.3. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

La muestra se sometió a las siguientes operaciones:

1. Limpieza y selección considerando la separación de tierra, semillas y sustancias extrañas.

2. La estabilización de la muestra se realizó a 60ºC por 10 minutos, con el fin de inactivar enzimas y evitar la degradación de los componentes en la muestra recolectada.

3. Para el secado de la muestra estabilizada, se sometió a temperatura ambiente bajo la sombra y con ventilación natural por cinco días, con el fin de evitar alguna alteración en sus constituyentes.

4. Después de la desecación, el material vegetal, solo se seleccionó las hojas y flores de la parte aérea de Luma chequen (Molina) A. Gray “Arrayán”, descartando los tallos, por tener mínima cantidad de aceite esencial.

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2.4. DETERMINACIÓN DE LA HUMEDAD

Método: Gravimétrico (Chávez, 2002; Pérez, 2002; Juárez, 1993)

Fundamento: Los vegetales por acción del calor, pierden agua de su constitución; obteniendo el porcentaje del mismo por diferencia de pesos.

Procedimiento: Luego de recolectada la muestra se llevó inmediatamente al laboratorio químico, se pesa en una balanza analítica una muestra por triplicado, cada vez que se recolectó. Luego se coloca en una estufa eléctrica previamente calentando a 110ºC por tres horas, la muestra se enfría en un desecador y se pesa hasta peso constante.