a) Material de estudio
Tejido adiposo visceral (n=24): las muestras de los perros con SC (n=8),
diagnosticados mediante el protocolo mencionado en la introducción (ver:
“Diagnóstico del SC”), fueron obtenidas durante la adrenalectomía (en aquellos pacientes con tumor adrenocortical) y por necropsia (aquellos pacientes con tumor
hipofisario que requirieron la eutanasia o que murieron en el Hospital Escuela-FCV).
Las muestras de los perros control (n=8), perros normopesos sanos, y obesos (n=8)
fueron obtenidas durante intervenciones quirúrgicas menores (ej:
ovariohisterectomía).
En los perros obesos, se descartó que no tuvieran ninguna enfermedad endócrina
concurrente (hipotiroidismo, SC, DM) así como cualquier otra afección sistémica
(cardiopatía, hepatopatía, neoplasias, enfermedad infecciosa), o que hubieran
recibido cualquier medicación (en particular corticoterapia y/o anticonvulsivantes) en
los 60 días previos a la incorporación de los perros en el estudio. El diagnóstico de
91 Estudio de la 11β-HSD1 y del GLP-1 en perros con Síndrome de Cushing
1997; Jeusette y col., 2010). Se incluyeron exclusivamente aquellos perros con CC
de 8 y 9.
b) Ensayo inmunohistoquímico
A partir de tacos de parafina de grasa visceral se realizaron cortes de 5 um, los
cuales se desparafinaron mediante pasajes en xilol y alcoholes de gradación
decreciente. Luego se realizaron lavados con PBS pH 7.6 y se permeabilizó la
muestra con tritón 1x en PBS. Luego de realizar nuevos lavados, se bloqueó la
actividad de peroxidasa con H2O2 3%. Se realizaron nuevos lavados y se
bloquearon los sitios de unión inespecífica con suero bloqueante (suero caprino en
PBS) por 10 minutos; para luego realizar un lavado con PBS. Los cortes fueron
incubados por 2 horas a 37º con una dilución 1:50 en PBS del anticuerpo policlonal
de conejo contra la región de aminoácidos 65-164 de la enzima 11β-HSD1 (Santa Cruz Biotechnology, H-100, sc-20175). Después de otros dos lavados, se utilizó el
sistema de detección “Immunoperoxidase detection system” (Millipore IHC Select). Este sistema utiliza el método avidina-biotina-peroxidasa (ABC), por lo cual los
cortes se incubaron 10 minutos con el anticuerpo secundario “anti-conejo” biotinilado y, luego de otro lavado, se incubaron 10 minutos con peroxidasa de rábano picante
(HRP) conjugada con streptavidina, y finalmente fueron lavados con PBS. El
revelado se realizó con el cromógeno 3,3´ diaminobencidina (DAB). Los cortes
fueron teñidos con hematoxilina (como contraste) por 5 minutos, deshidratados (con
alcoholes de gradación creciente y xilol) y montados con Bálsamo de Canadá. En los
cortes que se utilizaron como controles negativos no se colocó el anticuerpo
92 Estudio de la 11β-HSD1 y del GLP-1 en perros con Síndrome de Cushing
- Análisis de imágenes: para la captura de imágenes se utilizó la cámara digital
DC180 y un microscopio trinocular Leica, Modelo DMLS. Se trabajó con el software
Qwin Plus Leica Inc. Corp. Se evaluaron imágenes de 30 campos no consecutivos
en cada corte de grasa para determinar la intensidad de la inmunomarcación de la
11β-HSD1. Para ello, dos observadores (independientes al proyecto de investigación) analizaron las imágenes, las cuales fueron graduadas de acuerdo a la
intensidad de la marca. Se asignaron los siguientes valores (Oberholzer y col., 1996;
Ahmad y col., 2011): “0” sin inmunomarcación, “1” inmunomarcación débil, “2” inmunomarcación moderada; “3” inmunomarcación fuerte.
c) Western blot
- Extracción de proteínas a partir de muestras de tejido adiposo
Las muestras de tejido adiposo visceral fueron homogeneizadas en 5 ml de Buffer
de lisis (10 mM Tris-HCl [pH 8], 1% Triton X-100 y 0.5 mM de ácido acético) con un
cocktail de inhibidores de proteasas (HEPES 25 mM, Sacarosa 250 mM, EDTA 4 mM, Leupeptina 1 uM, Aprotinina 1 uM y Pepstatina 1 uM, a pH 7,4). Los
homogenatos fueron centrifugados a 12000g durante 10 minutos a 4°C. Se colectó
el sobrenadante.
- Determinación de proteínas
Las proteínas se cuantificaron mediante el método de Bradford (Bio-Rad
Laboratories) (Sapan y col., 1999), utilizando seroalbúmina bovina (BSA) como
93 Estudio de la 11β-HSD1 y del GLP-1 en perros con Síndrome de Cushing
lecturas de absorbancia a 595 nm en un lector de placa de ELISA (Bio Rad
Microplate Reader).
- Electroforesis en matriz de poliacrilamida
Cantidades iguales de proteína por muestra (30-40 g) fueron desnaturalizadas
sometiéndolas a ebullición durante 5 minutos en Buffer cracking (0,06 M Tris -HCl
[pH 6,8], 25% v/v de glicerol, 2 % w/v de SDS, 0,01 % w/v azul de bromofenol y 5 %
v/v β-mercaptoetanol). Luego se sometieron a una electroforesis en gel de poliacrilamida, conteniendo dodecilsulfato de sodio (SDS), en condiciones
desnaturalizantes (SDS PAGE), según la técnica descripta por Laemmli (Laemmli,
1970), y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad Laboratories),
según el procedimiento descripto por Towbin (Towbin, 1979).
La electroforesis se llevó a cabo empleando un sistema discontinuo, con dos tipos
de gel: un gel concentrador (4% de acrilamida-bisacrilamida (29:1) en buffer Tris-HCl
0,5 mM; pH 6,8), y un gel separador (10 % de acrilamida-bisacrilamida (29:1) en
buffer Tris-HCl 1,5 mM; pH 8,8). El buffer utilizado para la corrida fue Tris 0,025 M; glicina 0,192 M, SDS 0,1 % P/V, pH 8,3). La misma se desarrolló a voltaje constante
(70 V para el gel concentrador y 150 V para el gel separador), empleando un
dispositivo de BioRad (Miniprotean III). Finalizada la corrida electroforética, el gel fue
equilibrado en buffer de transferencia semi-seca (Tris-HCl 25mM, glicina 0,192 M y
metanol 20% V/V, pH 8,3). Las proteínas fueron luego transferidas a la membrana
de nitrocelulosa equilibrada en el mismo buffer. El proceso se desarrolló a corriente
94 Estudio de la 11β-HSD1 y del GLP-1 en perros con Síndrome de Cushing
se tiñó con una solución de Rojo Ponceau-ácido acético (0,2-0,5 %) para verificar la
transferencia de las proteínas. El colorante fue luego removido mediante sucesivos
lavados en una solución de PBS, conteniendo 0,1 % de Tween (PBS-Tween).
- Revelado de proteínas específicas
A fin de bloquear posibles sitios de unión inespecífica del anticuerpo, la membrana
fue incubada en una solución de PBS-Tween y leche descremada al 5% (durante 16
horas) a 4°C (en heladera). La incubación en presencia del anticuerpo específico se
llevó a cabo durante 16 horas a 4°C en agitación constante. Los anticuerpos
primarios empleados fueron: anticuerpo policlonal de conejo contra la región de
aminoácidos 65-164 de la enzima 11β-HSD1 (Santa Cruz Biotechnology, H-100, sc- 20175) (dilución 1:200) y anti-GAPDH de conejo G9545 (dilución 1:100000). Luego
de sucesivos lavados con PBS-Tween 0,1%, la membrana fue incubada por 1 hora
en presencia de un anticuerpo secundario anti-IgG de conejo (dilución 1:4000),
acoplado a peroxidasa. Finalmente, el revelado se llevó a cabo incubando la
membrana durante 1 minuto en una solución sustrato de peroxidasa para la
quimioluminiscencia mejorada (ECL), se digitalizaron las bandas utilizando el GBOX
y se midió su intensidad con el software Image J (NIH, Bethesda, MD). Los
resultados se presentan relativizados a la proteína constitutiva (GAPDH).
d) Análisis estadístico
Previo a analizar la normalidad de las variables, los resultados de la experiencia
95 Estudio de la 11β-HSD1 y del GLP-1 en perros con Síndrome de Cushing
p<0,05) y expresadas como promedio ± SEM. Para analizar la expresión de la 11β- HSD1 mediante Western Blot se realizó un test de ANOVA de 1 vía y el test de
Tukey´s.
Experiencia 4: Evaluación de la expresión de la eNOS en la zona fasciculada de