Evaluación de los métodos de disminución de la complejidad de las

Se calcularon las tasas de recuperación de cada sistema de acuerdo a la cantidad de proteínas cargadas y a la cantidad obtenida una vez finalizado el proceso, en el caso de Proteoprep® (PROTIA Sigma-Aldrich) las proteínas no retenidas por la columna

corresponden al 21.92% de las proteínas cargadas, mientras que para ProteominerTM (Cat #163-3006, Bio-Rad) las proteínas 2.23%.

Para comparar los perfiles proteicos obtenidos después del uso de los sistemas de reducción de la complejidad, ProteominerTM y Proteoprep® se usó únicamente una muestra de plasma, Plasma 1. Una vez tratadas las muestras, se realizó la comparación de los perfiles electroforéticos por medio de electroforesis unidimensional y bidimensional, figuras 5A y 6 respectivamente. Con el fin de evaluar la extensión de la depleción de IgG se efectuó inmunoensayo para detectar la proteína remanente, figura 5B.

Figura 5. Perfil electroforético de muestras de plasma con rango dinámico disminuido

25µg de proteína, correspondientes a cada tratamiento o fracción se separaron electroforéticamente; se tiñeron con azul de coomassie coloidal o se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa para un posterior western blot. A. Gel teñido con Azul de coomassie coloidal B. Película revelada resultado del Western blot contra IgG humana. Los carriles corresponden a 1. Plasma completo. 2. Plasma tratado por ProteominerTM. 3. Plasma tratado por Proteoprep®. 4. Proteínas retenidas Proteprep®. 5. Marcador de peso molecular PageRuler Unstained Broad Range Protein Ladder (26630, Thermo Scientific). 6. Patrón de albúmina humana (A3782, SIGMA)

Los perfiles proteicos obtenidos después de cada tratamiento son evidentemente distintos entre sí, es apreciable que aunque con ninguno de ellos se da la eliminación completa de la banda de correspondiente a la albúmina (figura 5A), ni de la correspondiente IgG, (figura 5B), si se observa una disminución drástica en la intensidad de las mismas, esto se corrobora al realizar un análisis densitométrico de las bandas

obtenidas por medio del programa Quantity One® (Bio- Rad) en donde se obtiene una disminución de entre el 75-85% en la intensidad dela banda correspondiente a IgG en las muestras tratadas por ProteominerTM y de entre el 73-80% en las muestras tratadas por Proteoprep®. De la misma forma al comparar con el perfil de la muestra inicial, ambos tratamientos exhiben un aumento en el número de bandas detectables, encontrando 15 bandas en la muestra sin tratar, 17 en la muestra tratada por ProteominerTM y 21 en la tratada por Proteoprep®.

Es notorio el aumento en la resolución de las bandas en las muestras tratadas con Proteoprep® comparada con las tratadas por ProteominerTM (figura 5A, carril 3 y 2 respectivamente), principalmente en la región de bajo peso molecular. Por otra parte, al evaluar el perfil de la fracción de proteínas retenidas por el sistema Proteoprep® (figura 5A, carril 4), se detectan pocas bandas además de las correspondientes a albúmina o IgG.

La figura 6 presenta el perfil bidimensional de la muestra Plasma 1 tratada con cada uno de los sistemas, en donde se observa un mayor número de spots en el perfil de las muestras tratadas comparado con el perfil de la muestra sin tratar. Si bien no es posible determinar a simple vista si existe una diferencia entre el número de spots totales encontrados para cada tratamiento, es evidente que existe una menor cantidad de spots en la zona de bajo peso molecular en la muestra tratada con ProteominerTM (figura 6B) comparada con la tratada por Proteoprep® (figura 6C).

Figura 6. Verificación de la reducción del rango dinámico en los perfiles electroforéticos bidimensionales de plasma humano

100µg de proteína obtenida después de cada tratamiento se separaron por 2D-PAGE, usando tiras de 7cm pH 3-10 y geles al 12% de poliacrilamida. Se empleó el marcador de peso molecular PageRuler Unstained Broad Range Protein Ladder (#26630, Thermo Scientific) y tinción con azul de coomasie coloidal A. Proteoma de plasma sin tratamiento. B. Tratamiento con ProteominerTM. C. Tratamiento con Proteoprep®

Figura 7. Perfiles proteicos bidimensionales de las fracciones descartadas por los sistemas de reducción de rango dinámico

100µg de proteína obtenida de las fracciones descartadas por cada tratamiento se separaron por 2D-PAGE, usando tiras de 7cm pH 3-10 y geles al 12% de poliacrilamida. Se empleó el marcador de peso molecular PageRuler Unstained Broad Range Protein Ladder (#26630, Thermo Scientific) y tinción con plata. A. Proteinas retenidas por el sistema Proteoprep® B. Proteinas no retenidas por el sistema ProteominerTM.

Adicionalmente debido al fundamento del sistema ProteominerTM, en la fracción obtenida por este método se da una “normalización” de las concentraciones de proteínas, con lo cual es posible que se dé una pérdida de información cuando se compara la concentración de una proteína en dos muestras distintas. Este factor es determinante a la hora de comparar proteomas propios de estados fisiológicos distintos en los que se busca observar diferencias cualitativas y cuantitativas, referidos no solamente a la ausencia y presencia de spots, sino a cambios en la intensidad de los mismos; el sistema Proteoprep® demuestra una menor intervención en las concentraciones de proteínas diferentes a la albúmina e IgG, en la Figura 7 se muestran los perfiles bidimensionales de las fracciones no usadas para cada sistema, donde esto queda bien demostrado. De acuerdo a lo descrito anteriormente, el sistema Proteoprep® se seleccionó como método a utilizar en el tratamiento de las muestras de plasma para estudios orientados a la identificación de potenciales biomarcadores.

Teniendo en cuenta las tasas de recuperación de proteína y que el sistema MALDI detecta cantidades en el orden de atomoles, se estableció que el formato de los geles a trabajar será de 7cm, los cuales además presentan una mejor reproducibilidad.