4. Estudio Farmacológico
4.4 Evaluación de la Toxicidad aguda de compuestos aislados de Renealmia
4.4.1 Método:
El ensayo de la toxicidad aguda se define como la evaluación de un síndrome tóxico producido por la administración de una o de varias dosis (dos o tres veces, o en infusión continua), en el transcurso de un día con un período de observación de hasta 14 días (OECD Guideline for Testing of Chemicals, 1995). Esta evaluación determina la letalidad e identifica los signos y síntomas producidos por sobredosis, fija las dosis adecuadas para los estudios de toxicidad a largo plazo (Vogel, 2006), establece el tiempo en el que aparecen los efectos tóxicos aditivos y brinda una información de la cinética toxicológica del producto.
Los principales objetivos de este ensayo fueron, la detección de los niveles de tolerancia aguda a los compuestos testeados y el establecimiento de la naturaleza de los síntomas de toxicidad aguda.
La evaluación de la toxicidad aguda de dos compuestos aislados (Pinostrobin-chalcona y Sakuranetina) de Renealmia alpinia se realizó siguiendo la Norma 423 de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OCDE Guía N°423, 2001). Los datos generales de las sustancias suministradas se presentan en la tabla 13.
Tabla Nº 13. Algunas características de los compuestos en estudio, aislados de R. alpinia
(Pinostrobin-chalcona y Sakuranetin).
Muestra A
Nombre Pinostrobin-Chalcona
Masa molar 270 g/mol
Características organolépticas Cristales sueltos, color naranja
Muestra B
Nombre Sakuranetina
Masa molar 286 g/mol
4.4.1.1 Preparación de la dosis
Para el ensayo se utilizaron cuatro ratones por grupo, tres para evaluar los productos a ensayar (tratamientos) y uno adicional al que se administró el vehículo en el cual fueron diluidas (buffer de fosfatos, PBS) las muestras y sirvió como control negativo para realizar las comparaciones estadísticas. A los grupos de tratamiento, se les administró la dosis empleada en el ensayo (300 mg/Kg) de manera independiente y consecutiva con verificación de la toxicidad en cada uno de ellos. En todos los casos, y de acuerdo a la siguiente formula, se administró por vía oral, 1 ml de muestra por 40 g de peso del ratón (ver tabla 14).
� = �ℎí� � � ó � � �ℎí�� ���� �� � ó � � ó = ���
Los ratones se sometieron a un período de ayuno de seis horas previas al experimento, con libre acceso al agua. Pasado este tiempo se administró por vía oral y con una sonda orogástrica la dosis (tratamiento) correspondiente a su peso corporal; mientras que el grupo control recibió únicamente el vehículo en el cual fue diluida la muestra (PBS). Una vez administrada la muestra, se continuó con el ayuno durante una hora más, con el fin de observar su respuesta y transcurrido este tiempo, se suministró a los ratones la dieta normal. En las primeras 24 horas posteriores a la administración, los ratones fueron observados cada 30 minutos durante la primera hora, luego cada 60 minutos hasta completar la cuarta hora y posteriormente cada 240 minutos hasta finalizar el día. En los días subsiguientes, los ratones se mantuvieron en observación durante un periodo de 14 días (por si ocurre retraso en la muerte), evaluando diariamente el peso corporal, las respuestas por parte de los animales frente a cada una de las dosis usadas, es decir, los signos de toxicidad, el tiempo
de aparición de éstos, la naturaleza, gravedad y duración de los efectos; así como también la mortalidad.
4.4.1.2 Registros de toxicidad y mortalidad
Cada uno de los días del período de ensayo (14 días) se evaluaron los signos de toxicidad macroscópicos relacionados con sistemas: nervioso central y somatomotor, autónomo, respiratorio, cardiovascular, gastrointestinal, genitourinario, piel y pelaje, membranas/mucosas y ojos. Estas observaciones realizadas, fuera de la cama de alojamiento, en un ambiente normal y siempre a la misma hora, fueron complementadas con una evaluación final de reactividad sensorial frente a estímulos tales como: visual, propiocepción, presión con fuerza y actividad motora (IPCS, 1986; Tupper and Wallace 1980; Gad, 1982; Moser, et al, 1991).
4.4.1.3 Seguimiento del peso corporal
La determinación del peso corporal es un parámetro importante, pues se constituye en uno de los indicadores más sensibles de perturbación de la homeóstasis. En esta evaluación se registró el peso corporal diariamente como medida adicional de la toxicidad a nivel sistémico.
4.4.1.4 Determinaciones en orina
Diariamente se evaluaron variables tales como: aspecto, color, cambios observables en el volumen de excreción y presencia de sangre en ella.
Pasados los 14 días de observación, los animales fueron sacrificados en cámara con CO2. Y se les realizó necropsia para determinar por inspección visual si habia signos de toxicidad en órganos como la cavidad abdominal, hígado, riñones, estómago, glándulas suprarrenales, testículos, epidídimo, útero, ovarios, timo, bazo, cerebro y corazón, según protocolo.
4.4.2 Resultados
No se presentó muerte o signos evidentes de toxicidad en ninguno de los animales en estudio tratados con Pinostrobin-chalcona y Sakuranetin (F-2, F-3) (Tablas 14 y 15), hecho que se corrobora con la ganancia de peso corporal (tabla 16 y figura 18) que si bien no es estadísticamente significativo, sí es reflejo de la inocuidad de los compuestos analizados (F-2 y F-3), pues una de las principales características de toxicidad es la pérdida en el peso corporal.
Tabla Nº 14. Respuesta a la muestra administrada a cada grupo de animales a la dosis administrada.
Grupos Toxicidad Evolución Muerte Día de la
muerte
Controles 0 N/A 0 N/A
C2H1 0 N/A 0 N/A C2H2 0 N/A 0 N/A C2H3 0 N/A 0 N/A C2M1 0 N/A 0 N/A C2M2 0 N/A 0 N/A C2M3 0 N/A 0 N/A C3H1 0 N/A 0 N/A C3H2 0 N/A 0 N/A C3H3 0 N/A 0 N/A C3M1 0 N/A 0 N/A C3M2 0 N/A 0 N/A
C3M3 0 N/A 0 N/A
Toxicidad = Número de animales que presenten signos de toxicidad Evolución = Evolución temporal de los efectos tóxicos y la reversibilidad Muerte: Número de animales muertos o sacrificados por razones compasivas N/A = No aplica.
C2H: Pinostrobin-chalcona Hembra. C2M: Pinostrobin-chalcona Macho C3H: Sakuranetin Hembra C3M: Sakuranetin Macho.
Tabla Nº 15. Determinación de las condiciones generales en cada uno de los sistemas orgánicos de los animales de experimentación tratados con la muestra.
Sistema
orgánico Observación y examen
Signos comunes de
toxicidad Resultado*
Nervioso Central y Somatomotor
Comportamiento Agresividad inusual, pesadez
y sedación. 0
Movimientos Temblor, ataxia, catatonia,
parálisis, convulsión. 0 Reactividad a varios estímulos Irritabilidad, pasividad, anestesia, hiperestesia 0 Reflejos cerebrales y
espinales Ausencia de reflejo 0
Tono Muscular Rigidez o flacidez 0
Nervioso
Autónomo Medida de la pupila Miosis, midriasis 0
Respiratorio Ventanas de la nariz
Descarga (coloreado y no
coloreado) 0
Carácter y rata Bradipnea, disnea 0
Cardiovascular Palpación de la región cardiaca Latido o pulsación, bradicardia, taquicardia, arritmia 0 Gastrointestinal
Eventos Diarrea, constipación 0
Forma abdominal Flatulencia, contracción 0
color arcilloso Genitourinario
Vulva, glándulas mamarias Hinchazón 0
Pene Prolapso 0
Región del perineo Sucia 0
Piel y pelaje Color, turgencia e
integridad
Enrojecimiento, flacidez,
erupciones, piloerección 0
Membranas y
mucosas Boca y conjuntiva
Congestión, hemorragia,
cianosis, 0
Ojos
Párpados Ptosis 0
Globo ocular Exostalmus, nistagmus, 0
Transparencia Opacidad 0
Otros
Temperatura rectal o de la
piel Anormal, incrementada 0
Sitio de inyección Hinchazón N/A
Condiciones generales Postura anormal,
emancipación 0
N/A = No aplica
*Grados de severidad: Sin lesión = 0, leve = 1, moderado = 2 y grave = 3
Tabla Nº 16. Registro del peso corporal de los animales de experimentación, tratados con la dosis de 300 mg/Kg de cada compuesto bajo estudio, durante 14 días.
Grupo/Dia 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 X±ES Control 20,9 20,9 21,0 21,1 21,5 21,6 21,7 21,9 22,1 22,5 22,9 23,0 23,4 23,4 2,5 C2H1 20,6 20,6 21,0 21,0 21,0 21,1 21,4 21,4 22,7 22,6 23,4 23,6 24,7 24,7 4,1 C2H2 22,0 22,5 22,9 22,9 23,0 23,6 23,8 24,4 24,9 25,2 25,7 25,8 27,7 27,8 5,8 C2H3 19,9 20,1 20,0 20,1 20,1 20,1 20,4 21,0 21,2 22,0 22,2 22,5 23,3 23,3 3,4 Control 20,7 20,8 21,0 21,0 21,3 21,5 21,8 22,0 22,1 22,5 22,8 23,0 23,4 23,4 2,7 C2M1 19,1 19,7 21,4 21,7 22,9 24,8 25,4 27,1 28,0 29,4 29,4 29,5 29,9 29,9 10,8 C2M2 18,0 18,4 20,8 21,2 22,4 24,8 25,9 26,4 28,4 28,4 28,6 28,8 28,8 29,0 11 C2M3 21,7 21,9 22,9 22,9 23,6 25,1 25,3 26,3 26,6 28,3 28,4 28,4 28,6 28,6 6,9
Control 21,9 21,9 22,1 22,5 22,6 22,8 22,9 23,1 23,5 23,6 23,9 24,1 24,1 24,2 2,3 C3H1 18,0 18,4 19,9 20,7 21,7 22,3 22,7 24,0 24,0 24,7 24,7 25,1 25,6 25,6 7,6 C3H2 20,4 20,4 20,7 20,7 20,9 21,0 21,1 22,3 22,5 22,7 22,7 23,3 24,9 24,9 4,5 C3H3 21,3 21,4 21,7 21,9 22,0 22,7 22,7 22,9 23,0 23,5 24,0 24,1 24,3 24,4 3,1 Control 20,4 20,5 20,7 20,7 20,8 20,9 21,0 21,0 21,3 21,5 21,7 21,8 22,0 22,0 1,6 C3M1 19,1 19,8 21,3 22,3 24,6 25,9 27,1 28,0 28,8 30,3 29,7 30,0 29,9 30,1 11 C3M2 20,0 21,8 23,9 24,7 25,3 27,1 27,2 27,9 28,2 28,5 28,6 28,9 28,6 28,6 8,6 C3M3 21,0 21,4 23,1 23,9 25,9 26,5 27,4 27,8 28,1 28,8 28,9 29,0 29,1 29,1 8,1
Los valores representan el error estándar (X±ES) de cada uno de los grupos de ratones tratados con la muestra bajo estudio, a dosis de 300 mg/kg.
C2H: Pinostrobin-chalcona Hembra. C2M: Pinostrobin-chalcona Macho C3H: Sakuranetin Hembra C3M: Sakuranetin Macho.
Figura 17. Ganancia de peso corporal de los animales de experimentación tratados con la dosis de 300 mg/Kg de cada compuesto bajo estudio, desde el inicio al final de la observación.
El aspecto y el color en la orina de cada uno de los animales empleados tanto en el grupo control como en los tratamientos fue normal y no se encontraron cambios en el volumen de excreción, ni presencia de hematuria en alguno de los grupos.
CO NTR OL C2H 1 C2H 2 C2H 3 CO NTR OL C2M 1 C2M 2 C2M 3 CO NTR OL C3H 1 C3H 2 C3H 3 CO NTR OL C3M 1 C3M 2 C3M 3 0 5 10 15 Di fe re n c ia d e p e s o
Las observaciones macroscópicas realizadas durante el sacrifico de los animales: parte externa del cuerpo, incluyendo cavidad abdominal y su contenido: hígado, riñones, glándulas suprarrenales, testículos, útero, ovarios, bazo, cerebro y corazón, no mostraron daño visible o aparente en los órganos.
Figura 18: Observaciones macroscópicas realizadas después del sacrifico de los animales.
4.4.3 Discusión
La administración de una única dosis (300 mg/Kg) de Pinostrobin-chalcona y de Sakuratenina, valorada durante 14 días de ensayo, no causó la muerte de ninguno de los animales de experimentación empleados en los tratamientos o el control, ni se produjeron signos aparentes de toxicidad que condujeran al sacrificio o el retiro de alguno de los animales del estudio.
En cuanto al peso corporal no se presentaron cambios estadísticamente significativos con relación al control negativo. Estos resultados suponen bajos niveles de toxicidad pues la variación en peso corporal es uno de los indicadores más sensibles de perturbación de la homeostasis; según la tabla 18, se observa un aumento a través del tiempo sin grandes
F-2, hembra F-2, macho
F-3, hembra
diferencias entre el peso inicial y final de los grupos tratados con relación al observado entre el peso inicial y final del grupo control.
Tampoco se presentaron signos evidentes de toxicidad aguda o alteraciones importantes (tabla 16) en los principales sistemas orgánicos analizados, tales como sistema nervioso central, cardiovascular, respiratorio, entre otros.
De acuerdo al Sistema de Clasificación Global Armonizado (SGA) y a las Guías OCDE los compuestos F-2 y F-3 no son tóxicos, ni representan riesgo aparente, administrados a una dosis de 300 mg/Kg; sin embargo, este ensayo, por sí sólo, no predice los posibles riesgos del consumo a dosis repetidas; por tanto, es de gran importancia profundizar en los estudios de toxicidad a mediano y largo plazo.
4.5 Inhibición de los efectos tóxicos del veneno de Bothrops asper por el extracto y
compuestos aislados de Renealmia alpinia
Para determinar las actividades inhibitorias en modelo in vitro de los efectos coagulante, proteolítico y hemolítico del veneno de B. asper, se prepararon mezclas (peso/peso) de las dosis mínimas de veneno inductoras de los efectos, extracto de la planta y los compuestos aislados F-1, F-2, F-3, F-4, D-1 y K-1 en proporciones 1:5, 1:10 y 1:20, se incubaron a 37 °C durante 30 minutos y una vez concluido éste tiempo se realizaron los ensayos, de acuerdo a los siguientes protocolos.
4.5.1 Inhibición de la actividad proteolítica sobre azocaseina
En ensayos realizados por triplicado y empleando como Dosis Proteolítica mínima –DPm- del veneno de B. asper 10 μg (Otero et al., 2000c), se prepararon muestras de veneno- extracto o de veneno-compuesto (en las proporciones mencionadas) disueltas en amortiguador Tris-HCl pH 7,4, de las cuales β0 μL se mezclaron con 100 μL de solución de azocaseína (10 mg/ml) y se transfirieron a temperatura de incubación por espacio de 90 minutos. Al término de éste tiempo, se detuvo la reacción por adición de β00 μL de ácido
tricloroacético (5%). La mezcla se centrifugó (2500 rpm/5 min), y al sobrenadante obtenido
se le agregó 100 μL NaOH (0.5 M). La actividad proteolítica se determinó por
cuantificación de la absorbancia (450nm), utilizando amortiguador Tris-HCl pH 7,4 como blanco y los extractos de las muestras y el veneno, tratados con el procedimiento descrito anteriormente, como controles negativos y positivo, respectivamente (Wang et al., 2004). Los resultados se expresan como el porcentaje de inhibición del efecto proteolítico. Este se determinó con la diferencia entre las absorbancias obtenidas para el extracto, cada compuesto y la mezcla veneno-extracto y veneno-compuesto, calculando el porcentaje de inhibición tomando la absorbancia del veneno como el 100% de proteólisis.
4.5.1.2 Resultados
Cuando el veneno de B. asper fue pre-incubado con el extracto de diclorometano de R. alpinia en relaciones variables, se observó inhibición de la actividad proteolítica del veneno de B. asper dependiente de la concentración (Fig. 19). La dosis de reto de 1:20 mostró inhibición de la actividad proteolítica de 88,53%. Por otra parte, la flavanona Pinostrobin mostró inhibición del efecto proteolítico inducido por el veneno de B. asper, aunque en menor grado que el extracto. Pinostrobin en una proporción de 1:20 mostró un porcentaje de inhibición del 21,86%. Estas diferencias fueron estadísticamente significativas. Los demás compuestos (F-2, F-3, F-4, D-1 y K-1) no mostraron actividad estadísticamente significativa sobre el efecto proteolítico del veneno de B. asper. A continuación, se muestran los resultados obtenidos para el extracto y el compuesto F-1 (Pinostrobin).
Figura 19. Inhibición del efecto proteolítico inducido por el veneno de B. asper por el extracto de
diclorometano y pinostrobin de R. alpinia. Las diferencias significativas se determinaron entre el
control respectivo, el compuesto y el extracto después de realizar ANOVA de una vía seguido por la prueba de Dunnett (* p <0,05, ** p <0,01 y *** p <0,001).
4.5.1.3 Discusión
La acción proteolítica del veneno de B. asper es generada principalmente por un tipo de toxinas, las hemorraginas o metaloproteasas, enzimas que causan separación de las uniones intercelulares de las células endoteliales y la posterior extravasación de los glóbulos rojos (Markland, 1998a, b). Los resultados mostraron una alta capacidad de inhibición del efecto proteolítico del veneno por el extracto de diclorometano de hojas de R. alpinia, lo que concuerda con los datos encontrados por los estudios realizados por Otero y col. (2000c) y Patiño y col. (2012).
Como ya es sabido, y con base en el estudio fitoquímico del presente trabajo, el extracto de hojas de R. alpinia, posee flavonoides, para los cuales se ha reportado la capacidad de formar complejos con Zn2+, alterando la actividad proteolítica mediada en parte por metaloproteinasas dependientes de Zinc (Dobbin & Hider, 1990; McDonald et al., 1996; Haslam, 1996). V:E 1:20 V:E 1:10 V:E 1:5 V:E 1:1 V:P 1:20 V:P 1:10 V:P 1:5 V:P 1:1 0 20 40 60 80 100 *** *** ** * *
Dosis Veneno:Extracto / Pinostrobin
% i n h ib ic ió n V:E: Veneno/Extracto V:P: Veneno/Pinostrobin
Si bien, la administración de pinostrobin no mejoró la inhibición de este efecto del veneno, se observó una actividad en la dosis de reto más alta de veneno : pinostrobin (proporción de 1:20), es probable que otros compuestos contribuyeron a la bioactividad del extracto, y por lo tanto la concentración requerida para que se observe mayor eficacia del pinostrobin puede ser bastante alta. Esta hipótesis debe ser abordada en estudios adicionales, junto con la identificación de otros agentes anti-proteolíticos potenciales en el extracto.
4.5.2 Inhibición de la actividad coagulante 4.5.2.1 Método
En ensayos realizados por triplicado, se mezclaron γ00 μL de plasma humano, colectados en tubos con citrato de sodio (γ,9 g/dL), con 50 μL de una solución de 1 μg de veneno con
las diferentes cantidades (5, 10 y β0 μg) del extracto y de cada uno de los compuestos aislados de R. alpinia en Solución Buffer de Fosfato – PBS- pH 7,2 (Núñez et al., 2004). Se utilizó la solución tampón, el extracto o compuestos y el veneno, tratados con el procedimiento antes descrito, como controles negativo y positivo, respectivamente. Se estableció como referencia el tiempo de inicio de la coagulación (Theakston & Reid, 1983; Gené et al., 1989). Los resultados corresponden a la diferencia entre el tiempo de coagulación obtenido con las mezclas veneno-extracto, veneno-compuesto y el tiempo de coagulación del control positivo de cada mezcla.
4.5.2.2 Resultados
El extracto de diclorometano mostró inhibición significativa in vitro del efecto de coagulación inducida por 1,0 mg de veneno, que corresponde a un tiempo de coagulación de 15,23 ± 0,14 s. Inicialmente, la actividad coagulante se mantuvo sin cambios a bajas proporciones de 1:5 (veneno-extracto ó veneno-pinostrobin w / w). Sin embargo, la extensión del tiempo de coagulación fue estadísticamente significativa cuando se usó el veneno con el extracto o con pinostrobin en una proporción de 1:20, con tiempos máximos de retardo para el inicio de la coagulación se reportó 24,10 ± 1,36 s y 17,30 ± 0,50 s,
respectivamente. A partir de esta relación, el efecto inhibidor se demostró que depende de la concentración del extracto. Del mismo modo, después de media hora de incubación, fue posible validar que las relaciones de extracto o compuesto utilizados para este ensayo no generaron actividad coagulante por sí mismos. Los demás compuestos (F-2, F-3, F-4, D-1 y K-1) no mostraron actividad estadísticamente significativa sobre el efecto coagulante del veneno de B. asper. A continuación, en la figura 20, se muestran los resultados obtenidos para el extracto y el compuesto F-1 (Pinostrobin).
Figura 20. Inhibición del efecto de coagulación inducida por el veneno de B. asper por el
extracto de diclorometano y pinostrobin de R. alpinia. Las diferencias significativas se
determinaron entre el respectivo control y el extracto o el compuesto después de realizar ANOVA de una vía seguido por la prueba de Dunnett (* p <0,05, ** p <0,01 y *** p <0,001).
4.5.2.3 Discusión
El veneno de B. asper afecta a la coagulación de la sangre al permitir la formación de fibrina a partir de fibrinógeno debido a la presencia de toxinas que activan las plaquetas y el factor XII, mientras que los factores moleculares V y VI encontrados en el veneno activan directamente el factor X. Las acciones conjuntas de las plaquetas, factor XII y el factor X luego dan lugar a un estado de hipercoagulabilidad en el paciente. Como el fibrinógeno se convierte en fibrina, se vuelve más inestable y susceptible a la lisis por los sistemas fibrinolíticos naturales. Por lo tanto el fibrinógeno se consume en grandes cantidades,
0 10 20 30 V V:E 1:20 V:E 1:10 V:E 1:5 V:E 1:1 V:P 1:20 V:P 1:10 V:P 1:5 V:P 1:1 *** * *** Tiempo (seg) V: Veneno B. asper V:E: Veneno/Extracto V:P: Veneno/Pinostrobin
evitando que la sangre se coagule y causando coagulación intravascular diseminada (Gutiérrez, 2011). Los componentes del extracto de R. alpinia tienen el potencial de interactuar con estas enzimas y evitar su efecto sobre la coagulación del plasma. De hecho, los resultados mostraron que el retraso en la coagulación era dependiente de la cantidad de extracto utilizado. Pinostrobin, en contraste, fue efectivo en retardar un poco el efecto de coagulación cuando se administran en una proporción de 1:20.
4.5.3 Inhibición de la actividad hemolítica indirecta 4.5.3.1 Método
Se definió como Dosis Hemolítica indirecta mínima – DHIm –(β,β μg para el veneno de B. asper) la menor cantidad de veneno que, luego de 20 horas a temperatura de incubación, genera un halo de 20 mm (Otero et al., 1992). La actividad hemolítica indirecta se determinó en ensayos realizados por triplicado, las mezclas preparadas de veneno-extracto y veneno-compuestos (en las proporciones 1:5, 1:10, 1:20) disueltas en PBS pH 7,2, se incubaron por un periodo de 30 minutos y se transfirieron a platos con agarosa-yema de huevo-eritrocitos (Gutiérrez et al., 1988), en los que permanecieron en una cámara húmeda por 20 horas a temperatura de incubación (37 °C). Pasado éste tiempo, se determinó la actividad inhibitoria por medición de los halos de inhibición, utilizando PBS pH 7,2, el extracto, los compuestos y el veneno, sometidos al procedimiento descrito, como controles negativos y positivos respectivamente, los cuales fueron sometidos al procedimiento ya descrito. Los resultados se expresan como el porcentaje de inhibición del efecto hemolítico indirecto, calculado tomando la medida del diámetro del halo de hemólisis del veneno como el 100% de hemólisis.
4.5.3.2 Resultados
La dosis hemolítica mínima indirecta (DHMI) del veneno de B. asper fue de 2,2 mg. El extracto de R. alpinia y pinostrobin se evaluaron y mostraron capacidad para neutralizar el efecto hemolítico del veneno y mostraron una actividad neutralizante similar (Fig. 21).
Cuando el veneno se pre-incubó con extracto de hojas de R. alpinia en proporciones de 1:20, 1:10 y 1:5, se observaron porcentajes de inhibición de 23,35%, 11,65% y 10,00%, respectivamente. Pinostrobin en proporciones de 1:20 y 1:10 mostró porcentajes de inhibición de 21,65% y 13,35%. Estas diferencias fueron estadísticamente significativas. Los demás compuestos (F-2, F-3, F-4, D-1 y K-1) no mostraron actividad estadísticamente significativa sobre el efecto proteolítico del veneno de B. asper. A continuación, se muestran los resultados obtenidos para el extracto y el compuesto F-1 (Pinostrobin).
Figura 21. Inhibición del efecto hemolítico indirecto inducido por el veneno de B. asper
por el extracto de diclorometano y pinostrobin de R. alpinia a diferentes dosis. Las
diferencias significativas se determinaron entre el control respectivo, el compuesto y el extracto después de realizar ANOVA de una vía seguido por la prueba de Dunnett (* p <0,05, ** p <0,01 y *** p <0,001).
4.5.3.3 Discusión
La hemólisis inducida por veneno de serpiente puede ocurrir a través de dos mecanismos: la hemólisis directa, la cual está mediada por la acción de un componente de proteína en el veneno, el factor lítico directo (FLD); y hemólisis indirecta, que requiere la acción de PLA2 del veneno en la lecitina de sustrato exógeno. PLA2 convierte la lecitina en lisolecitina (un tensioactivo), que es a su vez responsable de la hemólisis (Martínez, et al, 1991). El
V:E 1:20 V:E 1:10 V:E 1:5 V:E 1:1 V:P 1:20 V:P 1:10 V:P 1:5 V:P 1:1 0 20 40 60 80 100 *** ** * *** **
Dosis Veneno:Extracto / Pinostrobin
% i n h ib ic ió n V:E: Veneno/Extracto V:P: Veneno/Pinostrobin
resultado final de ambos mecanismos es la ruptura de las membranas de los glóbulos rojos, lo que conduce a la liberación de hemoglobina en el medio extracelular. Las capacidades del extracto y de pinostrobin para neutralizar el efecto hemolítico indirecto del veneno de B. asper (una indicación de la actividad PLA2) fueron similares cuando se evaluaron en las mismas concentraciones (Gómez-Betancur, et al, 2014) (Fig. 21).
La inhibición podría explicarse por la presencia de compuestos fenólicos en el extracto.