Evidencias morfológicas y moleculares de la coexistencia de dos

La mayoría de estudios sobre la estructura de poblaciones y patrones de asociación simbiótica en líquenes habían descrito la presencia de una única especie de fotobionte por talo. Sin embargo, cada vez existen más evidencias de la coexistencia de más de un genotipo de alga en talos liquénicos, como en las especies Evernia mesomorpha (Piercey-Normore, 2006) y Protoparmeliopsis muralis (Guzow- Krzeminska, 2006).

En trabajos recientes de nuestro grupo de investigación, se estudió la composición de ficobiontes de diferentes poblaciones de R. farinacea procedentes de áreas geográficas distantes: Península Ibérica, Islas Canarias y California (del Campo et al., 2010, Casano et al., 2011; del Campo et al., 2013). Mediante el análisis comparativo de su morfología con técnicas de microscopía óptica y electrónica, se demostró la presencia de un patrón de asociación altamente específico entre el liquen R. farinacea y dos fotobiontes del género Trebouxia, provisionalmente llamados TR1 y TR9 (Figura 1.7).

Figura 1.7. Sección transversal del talo de Ramalina farinacea teñida con azul de toluidina y observada con microscopio óptico, mostrando la localización de TR1 y TR9. Abreviaturas: (Co) Cortex; (ChT) Tejido condroide; (Hy) Hifas; (Phl) Capa gonidial. (Imagen tomada de Casano et al., 2011).

Este patrón de asociación ha sido verificado en cada uno de los talos de todas las poblaciones estudiadas mediante análisis moleculares basados en la secuenciación de una región del gen 23S ADNr (Figuras 1.8 y 1.9) y ITSnr (Figura 1.10), siendo consistentes con la diferenciación de ambos fotobiontes en base a su morfología (Casano et al., 2011; del Campo et al., 2013). Las secuencias obtenidas de los diferentes fotobiontes aislados en cultivo con cebadores que cubrían la región del gen 23S ADNr comprendida entre las posiciones 759-2596 del ortólogo de E. coli, resultaron ser idénticas a las de T. jamesii UTEX 2233 en el caso de TR1. Sin embargo, las secuencias obtenidas a partir de ADN de TR9, si bien eran muy similares a las de TR1 y T. jamesii, presentaba algunas diferencias notables. Como se observa en las Figuras 1.8 y 1.9, los tamaños de la porción secuenciada del gen 23S ADNr son muy diferentes en ambos fotobiontes (4352 nt en TR1 y 6655 nt en TR9). Esta diferencia de tamaños se debe a la presencia de intrones de tipo I distintos en número, distribución, longitud (Figura.1.8) y secuencia.

Figura 1.8. Mapas genéticos de la región del 23S ADNr secuenciada en TR1 y TR9. Las líneas negras representan los exones. Los intrones son representados con rectángulos verde claro. Los nombres de los intrones (de acuerdo con Johansen & Haugen, 2001) se indican encima de los mismos. Los marcos de lectura abierta, cuando existen, se señalan en el interior de cada intrón indicando el número de aminoácidos de las proteínas hipotéticas. La posición de los cebadores se indica en cada mapa mediante flechas rojas.

En base a las secuencias del gen 23S ADNr de las microalgas TR1 y TR9 aisladas, se realizó una primera caracterización molecular de los fotobiontes de R. farinacea en talos recolectados en diferentes localidades de la Península Ibérica, Islas Canarias y California. La Figura 1.9 muestra los productos de amplificación obtenidos a partir del ADN extraído de cada talo analizado, obtenidos con las parejas de cebadores: cL2263-F/cL2263-R, específica de TR1 o cL781-F/cL781-R, específica de TR9 cuyas posiciones se indican en Figura 1.8. Estos resultados y la posterior secuenciación de cada producto de amplificación, confirmaron la coexistencia de los dos fotobiontes en todos los talos analizados.

Figura 1.9. Electroforesis en gel de agarosa (1,5%) de los productos de amplificación por PCR obtenidos con las parejas de cebadores cL781-F/cL781-R (A) y cL2263-F/cL2263-R (B) a partir de ADN de talos de Ramalina farinacea recolectados en diferentes localidades (As, Asturias; Le, León; Ca, Castellón; Tf, Tenerife; MH, Monte Hamilton; SF, San Francisco) así como de fotobiontes TR1 y TR9 aislados en cultivo. Los tamaños de los marcadores de peso molecular (pb) se indican a la derecha. (Imagen tomada de Casano et al., 2011).

Con el objeto de confirmar los resultados obtenidos en base a secuencias del gen 23S ADNr, se utilizó un marcador adicional de codificación nuclear: los ITS del operón de ARNs ribosomales. Para ello, en base a las secuencias obtenidas de TR1 y TR9 con los cebadores de Kroken & Taylor (2000), se diseñaron otras dos parejas de cebadores específicas de TR1 o de TR9: la pareja ITS-TR1f/ITS-TR1r, que solamente amplificaba ADN de TR1; y la pareja ITS-TR9f/ITS-TR9r, que solamente amplificaba ADN de TR9.

Figura 1.10. Electroforesis en gel de agarosa (1,5%) de los productos de amplificación por PCR obtenidos con las parejas de cebadores ITS-TR1f/ITS-TR1r y ITS-TR9f/ITS-TR9r a partir de ADN extraído de talos de Ramalina farinacea recolectados en la Sierra del Toro (Castellón), así como de TR1 y TR9 aisladas en cultivo. Los tamaños de los marcadores de peso molecular (pb) se muestran a la izquierda. (Imagen tomada de Casano et al., 2011).

La Figura 1.10 muestra la electroforesis en un gel de agarosa de los productos de amplificación obtenidos con la pareja de cebadores ITS-TR1f/ITS-TR1r y ITS- TR9f/ITS-TR9r. El par ITS-TR1f/ITS-TR1r amplificó el ADN de los talos liquénicos y del fotobionte TR1, pero no de TR9. Por el contrario, el par ITS-TR9f/ITS-TR9r amplificó en los talos liquénicos y en el fotobionte TR9, pero no en TR1. La obtención de secuencias tanto de TR1 como de TR9 con los cebadores específicos para cada tipo de fotobionte confirmó la coexistencia de ambos tipos de fotobiontes en todos los talos. Sin embargo, cuando se emplearon cebadores “generales para algas del género Trebouxia”de Kroken & Taylor (2000) que amplificaban el ADN tanto de TR1 como de TR9 se obtuvo una única secuencia a partir de cada talo. Esta secuencia única resultó ser similar a la de TR9 aislada en todas las muestras procedentes de las Islas Canarias y similar a la de TR1 aislada en todas las muestras procedentes del resto de localidades.

los talos Canarios. De acuerdo con ello, se definió el término “ficobionte predominante” como el alga cuya secuencia de ITSnr es obtenida mediante la amplificación con cebadores genéricos de Trebouxia (Kroken & Taylor, 2000) y “ficobionte no predominante” como el alga cuya secuencia es obtenida sólo mediante la amplificación con el cebador específico de TR1 o TR9.