En las Figuras 14, 15 y 16 se muestra la evolución del pH a lo largo de 24h utilizando la saliva artificial SA03 con tratamientos que simularon acidosis ruminal (TAC) y tratamientos con cinco diferentes aditivos (SCI = levadura inactivada; INU = inulina; SOR = sorbitol; MAL = ácido málico; MDS = malato de sodio), cada uno de ellos en tres dosis (3, 9 y 15% de la MS del sustrato).
El pH de las unidades experimentales con el aditivo SCI, fue significativamente mayor (p<0,05) que el de TAC a las 4 h (9 y 15%) y a las 12 h (15%). En el resto de los casos mostró valores mayores que TAC aunque sin llegar a ser significativa su diferencia (p>0,05) (Figura 14).
En el caso de INU, sólo en la dosis menor (3%) tuvo diferencias significativas con TAC (p<0,05) con un valor mayor y sólo a las 4 h. En los demás casos no tuvo diferencias significativas (p>0,05) (Figura 14).
Para SOR, sólo se encontró diferencias significativas con TAC (p<0,05), para la dosis del 15%, a las 24 h, pero con un pH menor (Figura 15).
Respecto a MAL, Los tratamientos con 9 y 15 % fueron significativamente menores que TAC (p<0,05) al inicio del experimento, así como los que contenían la dosis mayor (15%) a las 4 h. Posteriormente los valores de pH se fueron haciendo cada vez más similares a los valores de TAC (p>0,05) (Figura 15).
Finalmente, los tratamientos con MDS, al inicio (0 h) no mostraron diferencias con TAC (p>0,05). A las 4 h, la dosis más baja mostró un pH significativamente mayor que TAC (p<0,05), así como las dosis 9 y 15 % a las 12 y a las 24 h (Figura 16).
Figura 14. Experimento 5. Evaluación del pH a lo largo de 24 h de fermentación. Se muestran los tratamientos experimentales con los aditivos SCI (levadura inactivada) e INU (inulina) incluidos en las dosis: 3, 9 y 15 % del sustrato total. En cada gráfica se incluye el tratamiento control (TAC). En todas las curvas trazadas se incluye el Error Estándar.
Figura 15. Experimento 5. Evaluación del pH a lo largo de 24 h de fermentación. Se muestran los tratamientos experimentales con los aditivos SOR (sorbitol) y MAL (ácido málico) incluidos en las dosis: 3, 9 y 15 % del sustrato total. En cada gráfica se incluye el tratamiento control (TAC). En todas las curvas trazadas se incluye el Error Estándar.
El análisis de los parámetros de las regresiones no lineales de pH en función del tiempo, arrojaron los siguientes resultados:
El parámetro pHf que expresa el valor que alcanzaría la variable pH hacia el final del experimento, mostró diferencias significativas (p<0,05) en los tratamientos SOR15, MAL15 y MDS15 respecto al tratamiento control, pero SOR15 y MAL15 resultaron menores al control, mientras que MDS15 fue mayor (ver Tabla XVI).
Para el parámetro VpH, que indica la variación de la variable pH entre el inicio y el final del experimento, los tratamientos que exhibieron diferencias significativas (p<0,05) con el control, fueron SOR09, SOR15; MAL15; MDS09 y MDS15 siendo sus valores: SOR15 > SOR09 > TAC > MDS09 > MAL15 > MDS15 (ver Tabla XVI).
En el caso del parámetro FAS, que marca la velocidad de descenso del pH, los únicos tratamientos que resultaron significativamente diferentes y además menores que el tratamiento control, fueron MAL09, MAL15, MDS09 y MDS15 (ver Tabla XVI).
Figura 16. Experimento 5. Evaluación del pH a lo largo de 24 h de fermentación. Se muestran los tratamientos experimentales con el aditivo MDS (malato de sodio) incluido en las dosis: 3, 9 y 15 % del sustrato total. En la gráfica se incluye el tratamiento control (TAC). En todas las curvas trazadas se incluye el Error Estándar.
Tabla XVI. Experimento 5. Comparación de los valores de los parámetros VpH, FAS y pHf, obtenidos de la regresión no lineal de los datos experimentales de pH, mediante ANOVA. Se muestran los valores medios de dichos parámetros y el error estándar del conjunto de datos de los mismos. En los casos que se encontró diferencias significativas (p<0,05) se aplicó el test HDS de Tukey, indicándose con letras diferentes en cada fila.
Pará- metro Aditivo ¥ Dosis EE§ pANOVA£ 0* 3 9 15 VpH SCI 1,275 1,295 1,371 1,284 0,0261 0,6118 INU 1,275 1,355 1,382 1,404 0,0173 0,0539 SOR 1,275a 1,356a,b 1,475b 1,512b 0,0341 0,0033
MAL 1,275a,b 1,328b 1,181a,b 1,100a 0,0325 0,0296
MDS 1,275b,c 1,345c 1,159b 0,969a 0,0461 0,0005 FAS SCI -0,128a,b -0,133a -0,135a -0,116b 0,0027 0,0314 INU -0,128 -0,130 -0,148 -0,149 0,0047 0,2414 SOR -0,128 -0,131 -0,123 -0,117 0,0033 0,4912 MAL -0,128a -0,114a,b -0,099b -0,066c 0,0071 <0,001 MDS -0,128a -0,120a,b -0,096b,c -0,094c 0,0051 0,0061 pHf SCI 5,31 5,37 5,38 5,40 0,018 0,2981 INU 5,31 5,33 5,33 5,30 0,019 0,9325 SOR 5,31b 5,31b 5,23a,b 5,17a 0,023 0,0323 MAL 5,31b 5,30b 5,26b 5,11a 0,090 0,0006 MDS 5,31a 5,33a 5,36a,b 5,46b 0,022 0,0203
Notas: Las comparaciones se muestran en filas. En los casos con diferencias significativas (p<0,05), los tratamientos diferentes se identifican con letras diferentes. * El tratamiento identificado como dosis 0 corresponde al tratamiento control.
Producción de NH
3El análisis del contenido en NH3, medido en las unidades experimentales
a las 24 h de fermentación (al final del experimento) no mostró diferencias significativas entre los tratamientos experimentales y el control (p>0,05).
Tabla XVII. Experimento 5. Contenido en NH3 (mEq/mL) en fermentadores anaeróbicos simulando acidosis ruminal con el agregado de aditivos. Valores correspondientes al final del experimento (24 h). Se presentan los valores medios de cada tratamiento y el error estándar del conjunto de datos comparado. Aditivo* Dosis § EE† P‡ 0 3 9 15 SCI 0,0039 0,0042 0,0051 0,0058 0,00037 0,32170 INU 0,0039 0,0042 0,0053 0,0035 0,00039 0,48450 SOR 0,0039 0,0030 0,0029 0,0049 0,00035 0,15090 MAL 0,0039 0,0032 0,0034 0,0026 0,00035 0,68690 MDS 0,0039 0,0024 0,0041 0,0030 0,00040 0,46340
* Identificación de los aditivos: SCI = levadura inactivada, INU = inulina, SOR = sorbitol; MAL = ácido málico, MDS = malato de sodio. § Todos los tratamientos están en las dosis: 3, 9 y 15 % del sustrato total. El tratamiento control (TAC) se incluyó como dosis 0. † Error Estándar. ‡ p real del ANOVA realizado para cada ácido y cada aditivo (todas las dosis). En ningún caso hubo diferencias significativas (p>0,05)
Producción de AGV
El análisis del contenido en AGV medido en las unidades experimentales con 24 h de fermentación (al final del experimento), permitió detectar una mayor producción de ácido propiónico (p<0,05) respecto al tratamiento control para los aditivos SCI (SCI09) y MDS (MDS03, MDS15), no habiendo diferencias significativas (p>0,05) para los otros aditivos. Tampoco se detectaron diferencias significativas (p>0,05) para los demás AGV para ningún aditivo.
La relación entre ácido acético y ácido propiónico (ACE:PRO) medida a las 24 h, mostró que sólo en aquellos tratamientos con malato de sodio (MDS) hubo diferencias con el tratamiento control, siendo las dosis al 9 y al 15% MDS significativamente menores (p<0,05). En todos los demás casos dicha relación no fue significativamente diferente del control (p>0,05).
Tabla XVIII. Experimento 5. Contenido en ácidos grasos volátiles (AGV) en fermentadores anaeróbicos simulando acidosis ruminal con el agregado de aditivos. Valores correspondientes al final del experimento (24 h). Se presentan los valores medios de cada tratamiento y el error estándar del conjunto de datos comparado. Los datos están expresados en mEq/mL.
Aditivo* Ácidos§ Dosis
0 3 9 15 EE† p‡
SCI
ACE 0,0217 0,0264 0,0299 0,0269 0,00161 0,3830
PRO 0,0059a 0,0076a,b 0,0095b 0,0071a,b 0,00049 0,0339
BUT 0,0043 0,0058 0,0067 0,0059 0,00043 0,2512 AGVt 0,0326 0,0408 0,0473 0,0410 0,00252 0,2395 INU ACE 0,0217 0,0225 0,0230 0,0239 0,00139 0,9665 PRO 0,0059 0,0062 0,0067 0,0080 0,00040 0,2678 BUT 0,0043 0,0049 0,0049 0,0054 0,00035 0,8116 AGVt 0,0326 0,0343 0,0354 0,0381 0,00212 0,8676 SOR ACE 0,0217 0,0225 0,0196 0,0208 0,00171 0,9580 PRO 0,0059 0,0067 0,0073 0,0076 0,00047 0,6607 BUT 0,0043 0,0049 0,0051 0,0046 0,00040 0,9244 AGVt 0,0326 0,0348 0,0328 0,0338 0,00052 0,9914 MAL ACE 0,0217 0,0216 0,0212 0,0197 0,00174 0,9849 PRO 0,0059 0,0070 0,0084 0,0080 0,00063 0,5603 BUT 0,0043 0,0049 0,0051 0,0044 0,00042 0,9129 AGVt 0,0326 0,0343 0,0355 0,0328 0,00270 0,9853 MDS ACE 0,0217 0,0305 0,0233 0,0254 0,00179 0,3710 PRO 0,0059a 0,0103b 0,0087a,b 0,0111b 0,00068 0,0076 BUT 0,0043 0,0066 0,0051 0,0065 0,00044 0,1635 AGVt 0,0326 0,0484 0,0380 0,0440 0,00279 0,2044
* Identificación de los aditivos: SCI = levadura inactivada, INU = inulina, SOR = sorbitol; MAL = ácido málico, MDS = malato de sodio. Todos los tratamientos están en las dosis: 3, 9 y 15 % del sustrato total. El tratamiento control (TAC) se incluyó como dosis 0. § Identificación de los ácidos grasos volátiles: ACE = ácido acético, PRO = ácido propiónico, BUT = ácido butírico, AGVt = ácidos grasos volátiles totales. † Error Estándar. ‡ p real del ANOVA realizado para cada ácido y cada aditivo (todas las dosis). Aquellos tratamientos en la misma fila que presentan letras diferentes tienen diferencias significativas entre si (p<0,05)
Tabla XIX. Experimento 5. Relación entre Ácido acético y ácido propiónico (ACE:PRO) en fermentadores anaeróbicos simulando acidosis ruminal con el agregado de aditivos. Valores correspondientes al final del experimento (24h). Se presentan los valores medios de cada tratamiento y el error estándar del conjunto de datos comparado.
Aditivo* Dosis EE† p‡ 0 3 9 15 SCI 3,56 3,51 3,13 3,77 0,121 0,3312 INU 3,56 3,61 3,49 2,97 0,121 0,2180 SOR 3,56 3,39 2,76 2,70 0,179 0,2265 MAL 3,56 3,21 2,60 2,46 0,182 0,0831 MDS 3,56b, 2,97a,b 2,67a 2,30a 0,161 0,0092
* Identificación de los aditivos: SCI = levadura inactivada, INU = inulina, SOR = sorbitol; MAL = ácido málico, MDS = malato de sodio. Todos los tratamientos están en las dosis: 3, 9 y 15 % del sustrato total. El tratamiento control (TAC) se incluyó como dosis 0.
† Error Estándar.
‡ p real del ANOVA realizado para cada ácido y cada aditivo (todas las dosis).
Aquellos tratamientos en la misma fila que presentan letras diferentes tienen diferencias significativas entre si (p<0,05)
DISCUSIÓN
El conjunto de los experimentos realizados en este trabajo buscó adaptar la técnica de fermentación in vitro para estudiar la acidosis ruminal. Esto implicó dos desafíos, encontrar una variable que resultara fiel a la hora de estudiar la simulación de dicha patología y evaluar el efecto potencial de sustancias que otros investigadores encontraron útiles para prevenir la acidosis ruminal (Fontenot & Huchette, 1993; Carro & Ranilla, 2003; Martin, 2005; Vyas et al, 2013).
Diversos autores han trabajado en modelos in vitro estudiando la funcionalidad ruminal midiendo, entre otras variables, el pH (Martin & Nisbet, 1990; Nisbet & Martin, 1991; Callaway & Martin, 1996; Martin, 1998). No se han realizado estudios que simularan una acidosis ruminal de manera similar a como se da in vivo, producida por la actividad de la biota ruminal sobre el sustrato. En cambio se realizaron ensayos in vitro partiendo de una situación de acidosis provocada por la adición de ácidos al inicio de los mismos (Martin, 1998; Martin, 2004; Colombatto et al, 2007; Kozloski et al, 2008).