La expresión de blsA aumenta en situación de hambreado severo

Con el objetivo de determinar en qué condiciones fisiológicas de A. baumannii es necesaria la fotorregulación a través de BlsA, se estudiaron los niveles de expresión del gen

blsA en diferentes situaciones utilizando la cepa ATCC 17978 de A. baumannii.

Así, efectuamos en primera instancia curvas de crecimiento en condiciones de medio líquido con agitación a 24° C (Figura 4.21) y a 37° C (Figura 4.22), en presencia de luz o en

70 oscuridad. Se observa que tanto las células que crecen en condiciones de luz azul, como aquellas en condiciones de oscuridad, presentan curvas de crecimiento normales y similares, indicando que la luz no afecta su crecimiento.

Figura 4.21. Curva de crecimiento de A. baumannii 17978 en cultivo líquido y en condiciones de luz (azul) y de oscuridad (negro) a 24° C.

Figura 4.22. Curva de crecimiento de A. baumannii 17978 en cultivo líquido y en condiciones de luz (azul) y de oscuridad (negro) a 37° C.

Posteriormente se midieron los niveles de expresión de blsA a partir de muestras tomadas de diferentes puntos de las curvas a ambas temperaturas.

Como se puede observar en la figura 4.23, los resultados indicaron que a 24° C los niveles del transcripto blsA son mayores en oscuridad que en luz durante toda la fase

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 500 1000 1500 2000 log DO 600 Tiempo (min) Luz Osc 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 500 1000 1500 2000 log DO 600 Tiempo (min) Luz Osc

71 exponencial. Sin embargo, en la fase estacionaria, estos valores fueron notablemente mayores, especialmente en oscuridad. Por el contrario, a 37° C, los niveles de expresión de

blsA fueron marcadamente menores que a 24° C tanto en fase exponencial como en fase estacionaria y similares entre luz y oscuridad.

Figura 4.23. Expresión del gen blsA en cultivo líquido con agitación a 24° C (puntos blancos con contorno) y a 37° C (puntos rellenos), en luz (azul) y oscuridad (negro).

De todos los puntos analizados en estas curvas, se eligieron algunos correspondientes a la fase exponencial y estacionaria de crecimiento tanto en luz, como en oscuridad y a 24° C y se tomaron muestras para analizar los niveles del fotorreceptor BlsA en las células en estas condiciones.

En la figura 4.24 se puede ver que cuando se hizo un inmunoensayo sembrando 350μg de proteínas totales de cada una de las cuatro condiciones ensayadas aparecen bandas correspondientes a la proteína BlsA. En la calle sembrada con el control positivo, la banda se ubica más arriba, debido a que este control corresponde a la proteína BlsA recombinante con una fusión a una cola de poli-Histidina necesaria para su purificación.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 500 1000 1500 Exp re sión r elat iv a ( b ls A/ re cA ) Tiempo (min) 24° C Luz 24° C Osc 37° C Luz 37° C Osc

72 Figura 4.24. Inmunodetección de BlsA en muestras de A. baumannii ATCC 17978 provenientes de cultivo a 24° C, correspondientes a la fase exponencial de crecimiento (F.Exp), o fase estacionaria (ON) y en condiciones de luz (L) y de oscuridad (O). El tamaño de la banda del MPM es de 15kDa.

La banda correspondiente a BlsA que aparece en la alícuota extraída del cultivo en fase estacionaria y en condiciones de oscuridad (O ON) tiene una mayor intensidad que la que se observa en las alícuotas extraídas de los cultivos en fase estacionaria en presencia de luz (L ON), así como de la fase exponencial tanto en luz (L F.Exp) como en oscuridad (O F.Exp). Esto indicaría que hay una mayor expresión de la proteína BlsA en condiciones de oscuridad en fase estacionaria que en las otras 3 muestras analizadas.

Además, se hicieron otros inmunoensayos para detectar BlsA en extractos de proteínas totales de mutantes ΔblsA (que no expresa el fotorreceptor) (Figura 4.26), ΔblsA

pWH1266-BlsA (Figura 4.25), la cual expresa una copia salvaje del gen blsA desde su propio promotor clonado desde el plásmido pWH1266 y la mutante ΔblsA conteniendo el vector vacío pWH1266 (Figura 4.26), como control. En todos los casos las alícuotas se tomaron en las mismas fases y condiciones que las alícuotas de la cepa salvaje que se muestran en la figura 4.24.

Figura 4.25. Inmunodetección de BlsA en muestras de mutantes en blsA que expresan una copia salvaje de BlsA desde su propio promotor en el plásmido pWH1266, provenientes de cultivo a 24° C, correspondientes a la fase exponencial de

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crecimiento (F.Exp) y a la fase estacionaria (ON) y en condiciones de luz (L) y de oscuridad (O). El tamaño de la banda del MPM es de 15kDa.

De aquí se puede ver, tal como era de esperarse, que en las cuatro muestras se expresa el fotorreceptor BlsA. Es importante mencionar que en este caso estamos analizando un sistema que no es natural, al expresar la proteína en cuestión desde un plásmido, por lo que la dosis génica varía y pueden estar influyendo diferentes factores que no necesariamente intervienen en las condiciones presentes en las células salvajes. Sin embargo, se puede observar que tanto para la fase exponencial como para la estacionaria, las bandas correspondientes a las condiciones de incubación en oscuridad son de mayor intensidad que las de luz. Esto indica que al igual que en las células salvajes se da la fotorregulación de la expresión de BlsA.

Los inmunoensayos realizados a partir de las proteínas totales extraídas de la mutante

ΔblsA y ΔblsA-pWH1266, no presentan bandas a la altura correspondiente al fotorreceptor, como era de esperarse, ya que ninguna de las dos cepas es capaz de sintetizar BlsA (Figura 4.26).

Figura 4.26. Inmunodetección de la proteína BlsA en muestras correspondientes a la cepa mutante en el fotorreceptor ΔblsA, la cual no lo expresa, así como la mutante transformada con el plásmido vacío utilizada como control, provenientes de cultivo crecido a 24° C hasta fase exponencial (F.Exp) y fase estacionaria (ON) y en condiciones de luz (L) y de oscuridad (O). El tamaño de la banda del MPM es de 15kDa.

4.2.4.2. Los niveles del ARNm de blsA, disminuyen al pasar de 24°C a 37°C en un cultivo en