CAPÍTULO 1 Análisis de la interferencia de la proteína E6 de VPH sobre el complejo de
4.1.3 La expresión de E6 18 induce una alteración de la localización subcelular de PAR 3
A partir de los resultados expuestos anteriormente se decidió analizar si las alteraciones en la localización de PAR 3 en células VPH+ se deben específicamente a la expresión de E6. En primera instancia se focalizaron los estudios en el efecto de E6 18 sobre PAR 3, ya que: i) se había observado la interacción E6 18-PAR 3 in vitro (Tomaic et al., 2008), ii) VPH 18 resultó el tipo de VPH más agresivo en modelos de transformación in vitro, utilizando células en cultivo (Lace et al., 2009), y iii) varios reportes indicaron un comportamiento clínico más agresivo y con peor pronóstico para tumores VPH 18-positivos,con respecto a VPH 16 (Walker et al., 1989; Zhang et al., 1995).
Para este objetivo, se utilizó la línea celular HaCaT ya que había sido demostrado, por otros autores, que constituye un modelo apropiado para el análisis de la formación de las UT
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(Aono and Hirai, 2008). Entonces, células HaCaT fueron transfectadas con los plásmidos codificando para HA-E6 18 o HA-E6 11 de manera transitoria. Como se observa en la Figura 4.5 PAR 3 adquiere una distribución difusa a lo largo del citoplasma y núcleo, en aquellas células que expresan HA-E6 18. Este efecto no se observa en células transfectadas con HA-E6 11 (que carece del PBM), donde PAR 3 se localiza preferentemente en los bordes celulares, como ocurre en células HaCaT sin transfectar (Figura 4.4). De esta manera, se pudo inferir que la proteína E6 18 tendría la capacidad de alterar la localización de PAR 3 en células epiteliales.
Figura 4.5: Efecto de la proteína E6 de VPH sobre la distribución de PAR 3 en células epiteliales. Las células HaCaT transfectadas con los vectores de expresión para HA-E6 11 o HA-E6 18 fueron fijadas y analizadas para la expresión endógena de PAR 3 por IF, utilizando un anticuerpo anti-PAR 3 producido en conejo y revelando con un anticuerpo secundario anti-IgG de conejo, conjugado con Alexa 488 (verde). La expresión HA-E6 11 o HA-E6 18 fue corroborada por IF usando anticuerpo anti-HA (producido en ratón) y anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con Cy3 (rojo). Las flechas blancas indican las células que expresan E6 de bajo o alto riesgo, las fechas amarillas indican localización de PAR 3 en los bordes celulares y las rojas en el citoplasma. Barra de tamaño 5m.
A posteriori, con el fin de abordar los estudios en un contexto más fisiológico, se generaron clones de células HaCaT expresando establemente las proteínas E6 11 y E6 18. La selección positiva de los mismos se efectuó con el antibiótico G418 (cuya resistencia se encuentra codificada en el vector de expresión pcDNA3 donde fueron clonadas las secuencias de E6, Figura 4.1) y su identidad se corroboró por detección de transcriptos y expresión proteica, por RT-PCR e IF respectivamente. Como se observa en la Figura 4.6, E6 18 presentó una localización nuclear y perinuclear mientras que E6 11 mostró una expresión principalmente citoplasmática, lo que concuerda con lo reportado por diferentes autores (Guccione et al., 2004; Mesplede et al., 2012). Corroborada la expresión de E6 en las distintas líneas celulares estables,
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se procedió a analizar por IF la distribución de PAR 3. Tanto en células HaCaT, utilizadas como control, como en células expresando E6 11 se observó la expresión de PAR 3 en los bordes celulares, en regiones de contacto célula-célula (Figura 4.6). Sin embargo, en células que expresaban E6 18, esta localización se vio alterada encontrándose una distribución nuclear y citoplasmática (Figura 4.6). Así, en concordancia con los experimentos de expresión transitoria de E6 (Figura 4.5), se pudo demostrar que E6 18 altera la localización de PAR 3, con probables cambios funcionales.
Figura 4.6: La expresión de la oncoproteína E6 18 está asociada con la alteración de la localización celular de PAR 3. Células HaCaT (control) o aquellas que expresan establemente HA-E6 11 o HA-E6 18(rojo), fueron fijadas y analizadas para la expresión endógena de PAR 3 (verde) por IF. Pueden apreciarse cambios en la localización de PAR 3 en células que expresan establemente E6 de alto riesgo (flecha amarilla), comparando con las células control (HaCaT) o aquellas que expresan E6 11, en donde PAR·3 localiza preferentemente en los bordes celulares (flecha blanca). En azul se observan los núcleos por tinción con el colorante fluorescente azul DAPI. Barra de tamaño 5m.
Para profundizar el estudio del efecto de E6 18 sobre la localización de PAR 3, fue utilizada la técnica de ARN de interferencia (siRNA) para silenciar la expresión de E6 18 en la línea celular HeLa la cual, como se mencionó anteriormente, expresa dicha proteína constitutivamente. Como control positivo del silenciamiento de E6, se analizó por IF el incremento en la expresión del supresor de tumores p53, principal blanco de E6 como fuera detallado en la sección 1.3.5.1 (Scheffner et al., 1993). Como se observa en la Figura 4.7, en aquellas células transfectadas durante 48 hs con siRNA E6 o con siRNA E6/E7 se distingue un
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aumento en los niveles de p53, la cual está localizada principalmente en el núcleo. Así se demostró, como fuera reportado por otros autores, el silenciamiento efectivo de E6 (Scheffner et al., 1993; Kranjec and Banks, 2011). En este experimento se silenció la expresión tanto de E6 como de E6/E7, ya que ha sido demostrado que al silenciar a E6 y E7 en conjunto, la ablación de E6 es más eficiente y, por lo tanto, la recuperación de p53 es más acentuada, como se observa en la Figura 4.7 (Kranjec and Banks, 2011). Como control negativo de silenciamiento, se utilizaron células HeLa silenciadas para Luci, ya que dicha proteína no se encuentra codificada en el genoma celular. En Figura 4.7 además, se aprecia un patrón difuso de PAR 3 en las células control, donde la marca se localiza principalmente en núcleo y citoplasma, con una leve expresión a nivel de los bordes celulares. Sin embargo, en aquellas células en donde se silenció la expresión de E6 18 (células p53+), se observó un incremento en la localización citoplasmática de PAR 3, con un enriquecimiento de dicha proteína en las uniones celulares. Este resultado concordó con lo mostrado para algunas de las líneas celulares epiteliales analizadas anteriormente (Figura 4.4), y como fuera reportado por otros autores (Joberty et al., 2000; Ebnet et al., 2001). De esta manera, los resultados de este experimento corroboran los datos anteriores acerca del efecto de E6 18 sobre la localización de PAR 3. Además, al demostrarse que la ablación de la proteína viral restaura la expresión de PAR 3 en los bordes celulares en células HeLa, se podría sugerir que la distribución diferencial de PAR 3 en estas células (Figura 4.4) se debería a la expresión de E6 18 en dicha línea tumoral.
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Figura 4.7.El silenciamiento de E6 18 en células HeLa restaura la expresión de PAR 3 en las uniones celulares. Células HeLa fueron transfectadas con: siRNA VPH 18 E6/E7, siRNA E6 18 o siRNA Luci durante 48 hs. Posteriormente, fueron fijadas y analizadas para la expresión endógena de PAR 3 por IF, utilizando un anticuerpo anti-PAR 3 producido en conejo y revelando con un anticuerpo secundario anti-IgG de conejo conjugado con Alexa 488 (verde). La expresión de p53 (control de silenciamiento) fue corroborada por IF usando anticuerpo anti-p53 (producido en ratón) y anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con Cy3 (rojo). Las flechas blancas indican localización de PAR 3 en los bordes celulares en aquellas células p53+. Barra de tamaño 5m.
A continuación, se evaluó si la localización nuclear de PAR 3 era específica, de manera de descartar que los hallazgos descriptos no eran un artefacto de la técnica o se deban a inespecificidad del anticuerpo utilizado. Para esto, se llevaron a cabo experimentos de silenciamiento de PAR 3, transfectando células HeLa con siRNA PAR 3 (Dharmacon pool) o siRNA Luci, como control. Al cabo de 72hs, las células fueron fijadas y se analizó la expresión de PAR 3 por IF. Como se puede apreciar en la Figura 4.8, en aquellas células tratadas con siRNA PAR 3 se pudo observar una marcada disminución de sus niveles y, específicamente, de su expresión a nivel nuclear, comparando con las células control (siRNA Luci). Por lo tanto, este resultado corrobora que la redistribución de PAR 3 hacia el núcleo en presencia de E6 18 es específica, y que no es un artefacto de los experimentos (Figura 4.8).
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Figura 4.8: El silenciamiento de la expresión de PAR 3 corrobora su localización nuclear en células HeLa. Células HeLa fueron transfectadas con: siRNA PAR 3 o siRNA Luci durante 72 hs, posteriormente fueron fijadas y analizadas para la expresión endógena de PAR 3 por IF, utilizando un anticuerpo anti-PAR 3 producido en conejo y revelando con un anticuerpo secundario anti-IgG de conejo conjugado con Alexa 488 (verde). Nótese la disminución de la marca nuclear de PAR 3 en las células silenciadas, lo que indica que la marca era específica.
Resumiendo, los datos presentados hasta el momento sugieren que la proteína E6 18 altera la localización subcelular de PAR 3, desde los bordes celulares hacia núcleo y citoplasma, lo que podría derivar en alteraciones en sus funciones celulares.Es importante destacar que las alteraciones mencionadas de PAR 3 no se observaron en células que expresan proteínas E6 derivadas de VPH de bajo riesgo, que carecen del sitio de interacción con dominios PDZ. En este sentido, restaba analizar a este punto la real contribución del sitio PBM de E6 18 en la alteración de la localización de PAR 3.