Extracción de RNA total en levaduras

7.4.1. Extracción con Trizol™ Reagent (Invitrogen)

A lo largo de esta tesis se han utilizado dos variantes de este método en el que se utiliza un preparado comercial a base de fenol y isotiocianato de guanidina, llamado Trizol™, desarrollado y suministrado por Invitrogen Life Technologies. Este preparado estabiliza el RNA en los pasos del protocolo posteriores a su introducción, de manera que queda relativamente protegido de la digestión por RNasas y de la ruptura y degradación generada por exposición a la temperatura ambiental, lo que convierte a este método en el idóneo si se va a utilizar el RNA en posteriores procesos y tratamientos. El Trizol™ puede ser utilizado también para la extracción de DNA y proteínas en células de plantas o tejidos de mamíferos, además de para la extracción de RNA en levaduras. La diferencia entre las dos variantes del método que aquí se presenta radican en el modo de abordar la ruptura de la pared de las

MATERIAL Y MÉTODOS

células de levadura necesaria para facilitar el acceso del Trizol™ al RNA, siendo llevada a cabo en un caso mediante pulverización, previa congelación en nitrógeno líquido, mientras que en el otro caso se utilizan perlas de vidrio que son añadidas a las células de levadura que son rotas mediante fricción mecánica generada por agitación vigorosa en vortex.

1. Se pone un preinóculo de la levadura a la que se le desea extraer el RNA, a crecer durante una noche (15-16 horas) en el medio de cultivo adecuado y a 30 ºC.

2. Se inoculan entre 100 y 200 ml de medio con el volumen necesario de preinóculo para que su densidad óptica (D.O.) sea 0,3-0,4 unidades de absorbancia a una longitud de onda de 600 nm. Poner a crecer a 30 ºC a agitación moderada (200-250 r.p.m.).

3. Esperar a que el cultivo alcance una D.O. de 0,8-0,9 unidades de absorbancia a una longitud de onda de 600 nm. El tiempo de crecimiento dependerá de la cepa de levadura y de las condiciones de cultivo. Una vez alcanzada la D.O. deseada se enfría el cultivo en hielo durante 5-10 minutos.

4. El cultivo se recoge en el bote y se centrifuga a 5.000 r.p.m. durante 3 minutos en frío.

Opción A: utilizando nitrógeno líquido para la ruptura de las levaduras. 5. Se retiran 5 ml de medio (sobrenadante) con una pipeta y se desecha el resto. Los 5 ml retirados son añadidos al sedimento celular y se resuspende en el mismo bote manteniéndose en hielo.

6. Se toma un tubo plástico de 10 ml y se introduce en el nitrógeno líquido llenándolo del mismo. Se espera hasta que cese el burbujeo y se saca del nitrógeno.

7. Se toman con la pipeta parte de los 5 ml de cultivo y se añaden gota a gota sobre el nitrógeno líquido del tubo para que se vayan formando una especie de bolas de levadura congeladas, repitiendo el proceso hasta agotar los 5 ml de células.

8. Se montan las cápsulas del pulverizador con su bola de tungsteno y se introducen en nitrógeno líquido. Una vez frías se abren sobre la placa petri, se abre un tubo con bolas de levadura congeladas y se toman con las pinzas una serie de bolas colocándolas en el interior de la cápsula para volverla a cerrar e introducirla de nuevo en nitrógeno líquido.

9. Se saca la cápsula del nitrógeno líquido y se monta en el pulverizador, procediendo a dar un pulso de 3 minutos a 2.000 r.p.m. Mientras, se prepara un tubo de vidrio con 10 ml de Trizol™ frío (4 ºC).

10. Se abre la cápsula del pulverizador y se retira el polvo de levadura con una cucharilla añadiéndoselo al Trizol™.

Opción B: utilizando perlas de vidrio para la ruptura de las levaduras. 5. Se retira 1 ml de medio (sobrenadante) y se desecha el resto. Se añade a las células precipitadas y se resuspenden en el mismo bote manteniéndolo en hielo.

6. Las células son transferidas a un tubo de vidrio y se mantienen en hielo. Se añaden perlas de vidrio de 0,3 cm de diámetro hasta abarcar 2/3

MATERIAL Y MÉTODOS

del volumen de células y se procede a su ruptura. Para ello se darán en vortex 15 pulsos de 20 segundos, enfriando en hielo 20 segundos entre pulso y pulso.

7. A continuación se añaden 10 ml de Trizol™ al tubo de vidrio. Final común del protocolo.

1. La mezcla de Trizol™ y levaduras se agitan con vortex durante 1 minuto y se deja reposar 5 minutos a temperatura ambiente.

2. Se añaden 2 ml cloroformo y la mezcla se agita en vortex 15 segundos, dejando reposar de 3 a 10 minutos a temperatura ambiente.

3. La mezcla se centrifuga a 10.000 r.p.m. durante 5 minutos a 4 ºC. Tras la centrifugación se pasa la fase acuosa (aprox. 5 ml) a un tubo de vidrio limpio.

4. A la fase acuosa se le añade ahora 5 ml de 2-isopropanol para la precipitación del RNA, se mezcla dando un toque de vortex y se deja reposar 10 minutos a temperatura ambiente.

5. La mezcla se centrifuga a 10.000 r.p.m. durante 10 minutos a 4 ºC.

6. Tras la centrifugación el RNA quedará pegado a la pared del tubo. Se desecha el líquido y se añaden al RNA, 2 ml de etanol al 75% libre de RNasas conservado a -20 ºC, mezclando a continuación con un toque de vortex. La mezcla se centrifuga a 10.000 r.p.m. durante 10 minutos a 4 ºC.

7. Se repite el paso anterior, tras lo cual se seca levemente el RNA durante 5 minutos en bomba de vacío.

8. El RNA se disuelve lavando las paredes del tubo de vidrio con 500 µl de agua tratada (tabla M.25) disparada con una pipeta automática. El RNA disuelto en agua es transferido entonces a un tubo plástico pequeño, donde se le añaden 500 µl del tampón de sales a base de LiCl (tabla M.26) y se mezcla con pipeta. La mezcla se deja reposar a -20 ºC de 2 horas a una noche.

9. La mezcla anterior se centrifuga a 15.000 r.p.m. durante 30 minutos a 4 ºC para recuperar el RNA.

10. Se desecha con cuidado el sobrenadante y se añade 1 ml de etanol al 75% libre de RNasas conservado a -20 ºC, mezclando con pipeta automática. A continuación se centrifuga la mezcla a 15.000 r.p.m. durante 15 minutos.

11. Se repite el paso anterior, tras lo cual el RNA se seca levemente durante 5 minutos en bomba de vacío.

12. El RNA es suspendido ahora en el mínimo volumen posible (en torno a 30 µl de agua tratada) y se mide su calidad y concentración bien al espectrofotómetro, bien en gel de agarosa.

Tabla M.25. Preparación de agua tratada. Después de mezclar el dietilpirocarbonato con el agua se deja reposar durante una noche y se esteriliza en autoclave.

Compuesto Cantidades para 1 litro

Agua bidestilada 999 ml

DEPC 1 ml

MATERIAL Y MÉTODOS

Tabla M.26. Composición del tampón LiCl utilizado en la extracción de RNA de levaduras mediante Trizol™.

Compuesto Cantidades por 100 ml

LiCl 16,96 g (4 M)

Tris-HCl 1 M, pH7,5 2 ml (20 mM)

EDTA 0,5 M 2 ml (10 mM)

Agua tratada Hasta 100 ml

7.4.2. Extracción con PCIAxRE

1. Se pone un preinóculo de la levadura a la que se le desea extraer el RNA, a crecer durante una noche (15-16 horas) en el medio de cultivo adecuado y a 30 ºC.

2. Inocular entre 100 y 200 ml de medio con el volumen necesario de preinóculo para que su D.O. sea 0,3-0,4 unidades de absorbancia a una longitud de onda de 600 nm.

3. Esperar a que el cultivo alcance una D.O. de 0,8-0,9 unidades de absorbancia a una longitud de onda de 600 nm. El tiempo de crecimiento dependerá de la cepa de levadura y de las condiciones de cultivo. Una vez alcanzada la D.O. deseada enfriar el cultivo en hielo durante 5 minutos

4. Pasar los cultivos a los botes de plástico de 250 ml previamente fríos y precipitar las células en la centrífuga refrigerada durante 5 minutos a 5.000 r.p.m.

5. Tras la centrifugación se descarta el sobrenadante y se resuspende el pellet en aproximadamente 25 ml de 1xRE frío (Tabla M.28).

6. Se centrifuga de nuevo en la centrifuga refrigerada durante 5 minutos a 5.000 r.p.m. y se descarta el sobrenadante. NOTA. En este momento se puede parar el protocolo congelando el precipitado a -20 ºC.

7. Se resuspende el precipitado en 2 ml de 1xRE frío y se pasa a un tubo de vidrio. Añadir perlas de vidrio de 3 mm de diámetro, lavadas con ácido nítrico y esterilizadas, hasta que alcancen la curvatura de la base del tubo de vidrio.

8. Se dan al menos 15 pulsos de 20 segundos cada uno en vortex, dejando el tubo en hielo entre pulso y pulso al menos 20 segundos para evitar su calentamiento.

9. Se añaden 2 ml de 1xRE + SDS 1% (10 ml de 1xRE y 0,5 ml de SDS 20%) a cada muestra. Agitación mediante vortex suave durante 20 segundos.

10. Se añaden 7,8 ml de PCIAxRE (tabla M.29). El tubo de vidrio se cubre con papel plástico. Toque de vortex para mezclar las fases.

11. Se centrifuga a 10.000 r.p.m. durante 10 minutos a 4 ºC. Mientras se centrifuga se preparan tubos de vidrio fríos con 5 ml de PCIAxRE (tabla M.29).

12. Se transfiere la fase acuosa superior (no tomar la interfase) al tubo de vidrio con PCIAxRE preparado antes. Se tapa con papel plástico. Toque de vortex para mezclar las fases. Se centrifuga a 10.000 r.p.m. durante 10 minutos a 4 ºC. Mientras tanto se prepara otro tubo de vidrio frío por muestra.

MATERIAL Y MÉTODOS

13. Se transfiere la fase acuosa superior (no tomar interfase) al tubo de vidrio preparado antes. Se añaden 2,5 volúmenes de etanol 95% y 1/10 de acetato sódico 3 M (5 ml de etanol y 0,5 ml de acetato sódico).

14. Se deja precipitando a -20 ºC una noche (15-16 horas). 15. Se centrifuga a 10.000 r.p.m. durante 10 minutos a 4 ºC.

16. Se añaden 10 ml de etanol 75% (preparado con agua tratada). Se resuspende el precipitado con pipeta automática y se centrifuga de nuevo durante 10 minutos a 10.000 r.p.m. y a 4 ºC.

17. Dar la vuelta a los tubos de vidrio sobre un trozo de papel secante hasta escurrir el etanol de las paredes. Se secan los tubos en bomba de vacío o al aire.

18. El RNA es suspendido ahora en el mínimo volumen posible (en torno a 30 µl de agua tratada) y se mide su calidad y concentración bien al espectrofotómetro, bien en gel de agarosa.

Tabla M.28. Composición del tampón 10xRE para la extracción de RNA total de levaduras. Se prepara 10xRE como stock y se diluye a 1xRE para uso. Ambas soluciones se preparan con agua tratada y se mantienen a 4 ºC. El tampón 10xRE se esteriliza en autoclave. Se debe ajustar el pH del agua tratada a 7,4.

Compuesto Cantidades por 100 ml

Tris 12,11 g (1 M)

LiCl 4,24 g (1 M)

EDTA 37 mg (1 mM)

Agua tratada Hasta 100 ml

Tabla M.29. Composición de la solución PCIAxRE para la extracción de RNA total de levaduras. El LiCl se prepara con agua tratada.

Compuesto Cantidades

Fenol equilibrado con 1xTE 100 ml

Cloroformo 100 ml

Alcohol isoamílico 8 ml

LiCl 5 M 2 ml

8. Cuantificación de ácidos nucleicos