Extracción de DNA de geles de agarosa para su visualización al microscopio

3.15.1. Preparación de muestras enriquecidas en RIs superenrollados.

Para aislar moléculas específicas correspondientes a CCRIs de plásmidos de replicación autónoma con las horquillas detenidas en los complejos Ter-Tus de un gel de agarosa se llevó a cabo el procedimiento descrito por Olavarrieta y colaboradores (Olavarrieta y col., 2002b) introduciendo algunas modificaciones.

Se analizó una muestra de formas replicativas de DNA del plásmido pBR18- TerE@StyI en un gel unidimensional de agarosa pero empleando las condiciones descritas anteriormente para una segunda dimensión, es decir, la concentración de agarosa en el gel fue del 1% y la electroforesis transcurrió a 5 V/cm a 4º C durante 10 horas y en presencia de 1 μg/ml de EthBr. En el primer pocillo del gel se cargó DNA del bacteriófago lambda digerido con HindIII como marcador de peso molecular y en la

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segunda una pequeña muestra de RIs de pBR18-TerE@StyI que sirvió para conocer la migración de cada una de las especies moleculares presentes en la muestra, incluyendo la de los CCRIs. El resto de los pocillos se unieron como si fueran uno solo pero de mayor longitud y poder cargar así un mayor volumen de muestra. La distribución de las muestras en el gel puede observarse en la figura 10A.

Figura 10. Esquema del método empleado para aislar CCRIs. A: Esquema de un gel en el que se

indica la ubicación de las muestras y las condiciones en las que se desarrolló la electroforesis. Tras la electroforesis el gel se dividió en dos partes, el gel representado en B se utilizó como control y del representado en C se aislaron los CCRIs enmarcados dentro de un rectángulo de color amarillo para su posterior anáisis al microscopio electrónico.

Una vez terminada la electroforesis se cortó el gel en dos partes. La porción de la derecha (figura 10C) con la muestra de DNA a extraer se mantuvo a 4ºC en el tampón de electroforesis TBE 1X. La porción de la izquierda (figura 10B) conteniendo el DNA del marcador de peso molecular, una pequeña muestra de la digestión con la enzima de restricción y parte de la calle con el DNA a extraer se examinó en un transiluminador de

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luz UV de 250 nm de longitud de onda y se midió la movilidad electroforética en centímetros de cada una de las formas de interés. De acuerdo con esta medición se cortó el trozo de gel de la figura 10C conteniendo las moléculas problema. Se introdujo la muestra en una membrana de diálisis con tampón TBE 1X y se extrajo el DNA del gel de agarosa por electroelución a 30 V durante 48 horas a 4ºC. Se precipitó la muestra con 0,1 volúmenes de acetato sódico 3M, pH 5,2 y 2,5 volúmenes de etanol 100% a -20º C y se resuspendió en agua destilada en presencia de 1 μg/ml de EthBr. Durante todo el proceso, la muestra estuvo en presencia de 1 μg/ml de EthBr. Para confirmar la pureza de la muestra extraída se corrió un gel unidimensional en las condiciones de electroforesis descritas anteriormente en al apartado 3.8.1.

3.15.2. Preparación de muestras enriquecidas en RIs digeridos con enzimas de restricción con horquillas de replicación en retroceso.

Para aislar moléculas específicas correspondientes a RIs de plásmidos de replicación autónoma con las horquillas detenidas en los complejos Ter-Tus con horquillas en retroceso y digeridos con una enzima de restricción de un gel de agarosa se llevó a cabo el procedimiento descrito en el apartado anterior introduciendo algunas modificaciones.

Se digirió una muestra de formas replicativas de DNA del plásmido pBR18- TerE@AatII con la enzima de restricción AflIII (New England Biolabs) en un gel unidimensional de agarosa pero, a diferencia del caso descrito anteriormente, se emplearon las condiciones descritas para una primera dimensión, es decir, la concentración de agarosa en el gel fue del 0,4% y la electroforesis transcurrió a 1 V/cm, a temperatura ambiente durante 24 horas. En el primer pocillo del gel se cargó DNA del bacteriófago lambda digerido con HindIII como marcador de peso molecular y en la segunda una pequeña muestra de RIs de pBR18-TerE@AatII digeridos con AflIII que sirvió para conocer la migración de cada una de las especies moleculares presentes en la muestra digerida, incluyendo la de los RIs acumulados. El resto de los pocillos se unieron como si fueran uno solo pero de mayor longitud y poder cargar así un mayor

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volumen de muestra. La distribución de las muestras en el gel puede observarse en la figura 11A.

Figura 11. Esquema del método empleado para aislar RIs linearizados. A: Esquema de un gel en el

que se indica la ubicación de las muestras y las condiciones en las que se desarrolló la electroforesis. Tras la electroforesis el gel se dividió en dos partes, el gel representado en B se utilizó como control y del representado en C se aislaron los RIs acumulados enmarcados dentro de un rectángulo de color amarillo para su incubación a 65ºC en presencia de 0,1M de NaCl y su posterior anáisis al microscopio electrónico.

Una vez terminada la electroforesis se cortó el gel en dos partes. La porción de la derecha (figura 11C) con la muestra de DNA a extraer se mantuvo a 4ºC en el tampón de electroforesis TBE 1X. La porción de la izquierda (figura 11B) conteniendo el DNA del marcador de peso molecular, una pequeña muestra de RIs del plásmido y parte de la calle con el DNA a extraer se examinó en un transiluminador de luz ultravioleta de 250 nm de longitud de onda y se midió la movilidad electroforética en centímetros de cada una de las formas de interés. De acuerdo con esta medición se cortó el trozo de gel de la

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presencia de buffer TNE (10 mM de Tris-HCl pH 8,0, 100 mM de NaCl y 0,1 mM de EDTA) durante 4 horas. A continuación, se introdujo la muestra en una membrana de diálisis con tampón TBE 1X y se extrajo el DNA del gel de agarosa por electroelución a 30 V durante 48 horas a 4ºC. Se precipitó la muestra con 0,1 volúmenes de acetato sódico 3 M, pH 5,2 y 2,5 volúmenes de etanol 100% a -20º C y se resuspendió en agua destilada. Para confirmar la pureza de la muestra extraída se corrió un gel unidimensional en las condiciones de electroforesis anteriormente descritas en el apartado 3.8.1.