1533 pacientes hipertensos i-SRA
PANEL PREDICTOR de dnA
4. EXTRACCIÓN PROTEICA Y AISLAMIENTO DE EXOSOMAS
La preparación de la muestra para su análisis proteómico o metabolómico es un paso crítico que va a limitar la cantidad y la calidad de los datos obtenidos. Es fundamental que las estrategias de extracción, purificación, concentración, limpieza, etc. sean compatibles con el tipo de análisis posterior seleccionado. En este apartado se indican los procedimientos empleados previos al análisis proteómico.
4.1. PRETRATAMIENTO DE LA MUESTRA DE ORINA: CONCENTRACIÓN Y DESALINIZACIÓN PREVIA A SU ANÁLISIS POR 2D-DIGE y SRM-LC- MS/MS
Debido a la gran cantidad de sales que hay en la orina es necesario llevar a cabo un proceso de desalinización antes de iniciar el análisis por electroforesis bidimensional en general y 2D- DIGE en particular, ya que de otro modo interfieren en el electroenfoque haciendo imposible la correcta separación de las proteínas de acuerdo a su punto isoeléctrico. Previamente en el laboratorio establecimos las condiciones de análisis por geles de electroforesis bidimensional (2-DE) y evaluamos métodos que permitían la limpieza y desalinización de las muestras de orina de un modo satisfactorio por cartuchos HLB Oasis® (Waters) [142].
Las muestras (20 ml) se descongelaron en un baño de agua a 37 °C unos minutos. Después de una agitación vigorosa, se filtraron a través de filtros de jeringa de 0,2 µm de poro y se ultrafiltraron por centrifugación a 3.000 x g para la concentración de las proteínas con filtros
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Amicon (10 kDa de corte, desechamos fracción peptídica <10kDa), hasta un volumen final de 300-350 µl, como muestra la figura 11.
Figura 11. Representación esquemática del protocolo seguido para la extracción de proteínas de la
orina. La muestra diluida en H2O Milli-Q después de su concentración por unidades Amicon se pasó
manualmente por medio de succión (jeringa) por cartuchos HLB Oasis y se recogió en tubos Eppendorf una vez limpias y eluídas en acetonitrilo (ACN).
La orina concentrada se diluye con agua Milli-Q a un volumen final de 500 µl y se carga en cartuchos Oasis® HLB previamente acondicionados con 1 ml de acetonitrilo (ACN) 100% y con una disolución de 1ml de ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1%. Tras un lavado con una disolución de 1ml de TFA al 0,1%, las proteínas retenidas se eluyeron en 0,5 ml de fase orgánica compuesta por ACN al 99%. Se eliminó el disolvente en un concentrador con vacío (SpeedVac) hasta llevarlo a sequedad y el precipitado se resuspendió en un volumen total de 50 µl de tampón de lisis compatible con el isoelectroenfoque (IEF) (7M urea, 2M tiourea, 4% de CHAPS, Tris-HCl 30 mM). El contenido total de proteína se midió por el método de Bradford antes del análisis por 2D-DIGE.
Para el análisis proteómico dirigido por SRM LC-MS/MS, se tomó en volumen de muestra correspondiente a 30 µg de proteína total, calculado en base al análisis bioquímico. En este caso, se emplearon columnas de desalinización (Thermo®) que admiten un volumen máximo de 120 µl. Por ello, el volumen correspondiente a 30 µg de proteína total se concentró en dispositivos Amicon de 3 kDa de corte de 0,5 ml (centrifugación a 4.000 x g) o 4 ml (centrifugación a 14.000 x g) según el volumen de partida. La muestra concentrada se acondiciona previamente a la tripsinización con columnas Protein Desalting Spin Columns de
3.000 x g Filtro Ø 0,2 µm Amicon 10 kDa Concentración de orina Limpieza de sales y enriquecimiento de la muestra por HLB Oasis Elución en ACN Evaporación de disolvente orgánico por SpeedVac Precipitado à suspensión y solubilizacíon proteica en tampón de
lisis 37ºC
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Thermo Scientific tal como indica el fabricante, en el cual se equilibra la columna, y se pasa la
muestra centrifugando a 1.500 x g durante 2 minutos. Posteriormente estas muestras se pudieron congelar a -80ºC hasta su utilización.
4.2. AISLAMIENTO DE EXOSOMAS DE LA ORINA
Las muestras de orina, con inhibidores de proteasas y congeladas a -80ºC se mantuvieron a temperatura ambiente durante una hora, se descongelaron en un baño a 37ºC unos 15 minutos y se agitaron vigorosamente empleando un vortex durante al menos 1 minuto para solubilizar bien las muestras. Este paso afectará al rendimiento final en la recuperación de exosomas [109]. En la figura 12 se detallan esquemáticamente representados los pasos del protocolo utilizado, previamente puesto a punto en nuestro laboratorio [74], [75]. Se necesitan al menos 60 ml de orina para un buen rendimiento de extracción de exosomas sobre todo en individuos normoalbuminúricos, en cuyo defecto se hicieron mezclas (“pooles”) de muestras para obtener la cantidad de proteína necesaria para cada análisis.
Figura 12. Representación esquemática del protocolo seguido para el aislamiento de exosomas y
proteínas exosomales para su posterior análisis proteómico, previamente puesto a punto en nuestro laboratorio.
El aislamiento de los exosomas se realizó por ultracentrifugación. En un primer paso, las muestras fueron sometidas a un primer paso de centrifugación a velocidad baja, 17.000 x g durante 10 minutos a 4ºC. Se recomienda llevar a cabo este paso en frío para minimizar la formación de agregados de la proteína uromodulina, también llamada proteína Tamm Horsfall (THP). El propósito de este paso de centrifugación es eliminar restos celulares y de membrana y recuperar el sobrenadante. Los agregados de THP dan lugar a redes que pueden atrapar exosomas disminuyendo el rendimiento. Por ello, se resuspende el precipitado resultante en
Descartar Exosomas 175.000 x g 17.000 x g Tratamiento con 200 mg/ml DTT Sobrenadante Precipitado Sobrenadante Precipitado Tampón de aislamiento o Tampón de aislamiento Tampón de lisis Proteínas exosomales
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500 µl de solución de aislamiento (10 mM trietanolamina y 250 mM sacarosa en H2O-milliQ, pH 7,6) con ditioterol (DTT) (200 mg/ml) y se calienta a 37ºC durante 10 minutos. Así se consigue disgregar estas redes y recuperar los exosomas atrapados en ellas [143]. Para separar los exosomas de los restos celulares del precipitado (“pellet”) tratado con DTT se centrifugó de nuevo en 10 ml de solución de aislamiento a 17.000 x g. Se recupera el sobrenadante y se une al obtenido en la primera centrifugación. Esta vez se descartó definitivamente el precipitado.
El sobrenadante de estas centrifugaciones se llevó a tubos de policarbonato especiales para la ultracentrifugación (Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, Beckman Coulter). Por cada 100 ml de sobrenadante se utilizaron 4 tubos de 25 ml de capacidad máxima cada uno y se sometieron a ultracentrifugación a 175.000 x g durante 70 minutos a 4ºC.
Se emplearon el menor número de tubos posible por muestra para aumentar el rendimiento en la extracción. Descartado el sobrenadante, se resuspendió el precipitado del primer tubo en 50 µl de solución de aislamiento si se van a almacenar los exosomas sin lisar o, si es para utilizarlo directamente, en tampón de lisis (7M urea, 2M tiourea, 4% de CHAPS, Tris-HCl 30 mM). Esta suspensión se transfirió al segundo tubo para resuspender el segundo precipitado de exosomas y así sucesivamente, hasta resuspender los cuatro precipitados exosomales en un mismo volumen de aproximadamente 50 µl.
La solubilización del precipitado exosomal generalmente es complicado, debido a que el precipitado en ocasiones no se resuspende fácilmente en un volumen tan pequeño. Además, es necesario secar bien las paredes del tubo y eliminar completamente los residuos de orina. Para una correcta solubilización del precipitado, se pipetea la solución una y otra vez sobre el precipitado, tratando de tocar lo menos posible las paredes del tubo y realizándolo lentamente, intentando no formar espuma.
Los exosomas solubilizados en solución de aislamiento o buffer de lisis se congelaron a - 80ºC. La cuantificación de proteína se hizo mediante el ensayo de Bradford. En este caso, directamente se procederá a su procesamiento específico para su análisis por iTRAQ o SRM- LC-MS/MS como se detallará a continuación.
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