Factores que afectan la germinación

Material vegetal

Todos los experimentos fueron realizados con semillas cosechadas en el mes de marzo de los años 2010 y 2011, excepto para los de almacenamiento en seco y en saturación hídrica, para los cuales se utilizaron semillas del 2011 y 2012. Se obtuvieron a partir de población naturalizada de una extensión de cinco hectáreas ubicada en el partido de Bahía Blanca (38°41'12,45"S; 62°12'56,08"O), en la cual D. fullonum era la especie dominante del área. El suelo presentaba un valor de 7,47 de pH y 997 µS.cm-1 de salinidad. Se colectaron semillas de 200 plantas las cuales fueron limpiadas y almacenadas a bajas temperatura (4°C) y baja humedad ambiente (≤ 50%) en bolsas de papel madera.

La semilla fue considerada madura cuando la inflorescencia que la soportaba se encontraba en senescencia. El peso de 1000 semillas fue de 3,26 g, 2,62 g y 2,22 g para las cosechas 2010, 2011 y 2012, respectivamente. Mediante el test de cloruro de 2,3,5- trifenil tetrazolium (Copeland, 1976) se determinó la viabilidad de las mismas y resultó en un 93,5%, 95,7% y 97,2% para cada año, respectivamente. Las semillas sanas fueron

a. b.

esterilizadas con hipoclorito de sodio 1:3 durante un minuto, para prevenir ataques de patógenos. Los experimentos se realizaron luego de dos meses de cosechadas.

Protocolo general de las pruebas de germinación

Todos los experimentos consistieron en cinco réplicas de 50 semillas del correspondiente año, ubicadas sobre dos hojas de papel “tissue” en cajas de Petri plásticas de 9 cm de diámetro (Fot. 2.2a). El papel fue inicialmente humedecido con 5 ml de agua destilada (o la solución adecuada según el tratamiento) para mantener una humedad apropiada. Las semillas no necesitaron tratamiento lumínico (Caswell y Werner, 1978). Al momento de evaluar la germinación, todas las cajas fueron envueltas en bolsas de polietileno transparente para prevenir la desecación y se colocaron en cámara de germinación en condiciones de temperatura controlada (24°C). El número de semillas que germinaron se determinó diariamente durante 30 días. El criterio que se usó para la germinación fue aquella que presentaba su radícula con una longitud de 2 mm (Fot. 2.2b). Al momento de evaluar la germinación se controlaba la humedad del papel de germinación y se realizaba el asperjado con agua destilada (o la solución adecuada según el tratamiento) según su necesidad.

La evaluación de los efectos de los tratamientos se realizó mediante el porcentaje de germinación (proporción de semillas germinadas sobre el total de semillas) y el coeficiente de velocidad de germinación (Ranal y Santana, 2006):

𝐶𝑉𝐺 = ∑ 𝐹𝑖 𝑘 𝑖=1 / ∑ 𝐹𝑖𝑋𝑖 𝑘 𝑖=1

Donde Fi: número de semillas germinadas en el día i; Xi: número de días de incubación y k: último día de germinación. La máxima velocidad (CVG=1) indica que todas las semillas germinan un día después de incubadas. Un alto CVG representa que un alto número de semillas germinaron más rápido. Asimismo, podemos comparar los cambios en la rapidez para germinar bajo diferentes condiciones ambientales.

5Fotografía 2.2. a. Unidad experimental para los experimentos de factores que afectan la germinación; b. Semillas de carda germinando.

Efecto de la temperatura

Las semillas que se encontraban almacenadas fueron puestas a germinar, siguiendo el protocolo general, a diferentes niveles de temperatura constante dentro de cámaras de germinación y totalmente en oscuridad. Los niveles utilizados fueron: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 y 36°C. Este rango refleja las temperaturas medias, máximas y mínimas que ocurren fundamentalmente en otoño y primavera en la zona de estudio (Paoloni, 2010).

Efecto del pH

Para examinar los efectos del pH en la germinación, se prepararon soluciones con pH crecientes entre 3 y 12 a intervalos de una unidad. Las mismas se ajustaron utilizando ácido clorhídrico 32% m/v e hidróxido de sodio 1N. El pH de la solución deseado fue confirmado utilizando un medidor de pH digital Hach EC10 modelo 50050. Las semillas fueron embebidas en cajas de Petri con 5 ml de cada solución en particular. Periódicamente, la solución fue extraída de la caja y reemplazada con el objeto de mantener el pH estable. Las semillas fueron puestas a germinar a 24°C en cámaras de germinación.

Estrés osmótico

Se realizaron seis tratamientos para determinar el efecto del estrés osmótico en la germinación. Las semillas fueron puestas a germinar en soluciones acuosas con diferentes potenciales osmóticos de 0 (testigo agua destilada); -0,1; -0,2; -0,4; -0,6; -0,8 y -1 MPa. Las soluciones se obtuvieron disolviendo 56,5; 93,6; 148,8; 192,2; 229,2 y

262 gramos de Polietilen Glicol (PEG) 6000 en 1 litro de agua destilada, respectivamente. La cantidad requerida de PEG 6000 fue determinada de acuerdo a Michel y Kaufmann (1973).

Concentración salina

Se obtuvieron soluciones salinas disolviendo cloruro de sodio en agua destilada, obteniéndose siete concentraciones crecientes (10, 20, 40, 80, 160, 320 y 640 mM), que se compararon con un testigo 0 mM (agua destilada). Se pusieron a germinar semillas, siguiendo el protocolo general, embebidas en las concentraciones de NaCl mencionadas, que reflejan el contenido salino de los suelos de la Provincia de Buenos Aires (Paoloni, 2010).

Almacenamiento en seco

Se colocaron 50 semillas en sobres de papel madera, los cuales se almacenaron en cámaras de crecimiento a diferentes temperaturas 0, 10, 20 y 30°C por períodos de 0, 30, 60, 90, 120, 240 y 360 días después de la cosecha, luego se pusieron a germinar siguiendo el protocolo general. En el tratamiento de cero días, las semillas fueron puestas a germinar inmediatamente después de la cosecha luego de realizada una limpieza de las mismas.

Almacenamiento en condiciones de saturación hídrica

Se colocaron 50 semillas cosechadas en el 2011 y 2012 en recipientes, embebidas en agua destilada (simulando una inundación) a una temperatura en la cual no promueva la germinación (menor a 6°C) por períodos de 0, 30, 60, 90, 120 y 240 días luego de la cosecha. En el tratamiento de cero días, las semillas fueron puestas a germinar inmediatamente después de la cosecha luego de realizada una limpieza y selección de las mismas. Terminado cada período de almacenamiento, las semillas se secaron con papel tissue y se pusieron a germinar siguiendo el protocolo general.

Análisis estadístico

Para los ensayos en laboratorio se utilizaron diseños experimentales completamente al azar, excepto para el experimento de almacenamiento en seco, en el cual un diseño de parcela dividida fue utilizado, con la temperatura como factor principal y el período como factor secundario. Los tratamientos de cada experimento

fueron replicados cinco veces. Cada réplica, de cada tratamiento, fue puesta al azar dentro de la cámara de germinación y se reordenaron las cajas diariamente. Los datos fueron procesados a través de un análisis de la varianza (ANOVA). Previamente se evaluó la normalidad (Shapiro-Wilks p<0,05) y homogeneidad de varianzas (Levene

p<0,05). Los datos fueron transformados con la función arcoseno raíz cuadrada para corregir la falta de supuestos (Snedecor y Cochran, 1956). La comparación de medias se realizó por medio del test de DMS de Fisher (p<0,05). Los análisis se efectuaron utilizando el software estadístico INFOSTAT (Di Rienzo y otros, 2015) y los modelos ajustados utilizando el software CurveExpert 1.3 (Hyams, 2005).

En el caso de los valores obtenidos a diferentes potenciales osmóticos, se ajustó un modelo logístico de tres parámetros de la forma:

𝐺 = 𝐺𝑚𝑎𝑥/(1 + 𝑥

𝑥₅₀)𝐺𝑟𝑎𝑡𝑒

Por otro lado, la germinación obtenida a distintas concentraciones salinas se ajustó mediante un modelo exponencial de tres parámetros de la forma:

𝐺 = 𝐺𝑚𝑎𝑥 /(1 + 𝑒𝑥𝑝 (−

𝑥 − 𝑥50

𝐺𝑟𝑎𝑡𝑒 )

Donde G representa la germinación (%) a un potencial osmótico y/o concentración salina x, x50 es el potencial osmótico o la concentración salina para alcanzar el 50% de

la germinación, Gmax es la germinación máxima y Grate determina la caída de la curva.

Los valores de velocidad de germinación obtenidos a diferentes potenciales osmóticos y concentraciones salinas fueron ajustados a los mismos modelos, respectivamente (Chauhan y otros, 2006).