Algunas causas de la falta reproducibilidad en los tiempos de migración de los análisis en capilares de sílice sin recubrir
Uno de los inconvenientes de la CE es que, en algunas separaciones, sufre de una falta de reproducibilidad en los tiempos de migración entre análisis [53, 54]. Este hecho es quizá uno de los mayores obstáculos para que la CE se popularice como método de análisis. Los tiempos de migración en CE suelen tener una RSD en torno al
1%, y existen ocasiones, como se describirá repetidamente en esta Memoria, en que esa reproducibilidad no es suficientemente buena para dar lugar a resultados fiables.
Existen múltiples factores que afectan a la reproducibilidad cualitativa y cuantitativa de la CE [53]. En esta Introducción, se describirán en detalle aquéllos que afectan a los tiempos de migración de los analitos porque ha sido la reproducibilidad que con más profundidad se ha estudiado en el trabajo recogido en esta Memoria. En las ecuaciones 9, 10, y 11 se indican los factores que afectan al tiempo de migración en CZE, con el objeto de estudiar en detalle la importancia de éstos sobre la
reproducibilidad de dicho tiempo de migración. En estas fórmulas, tm corresponde al
tiempo de migración, L a la longitud total del capilar, l a su longitud efectiva, V al
voltaje de separación, μeff a la movilidad electroforética, μEOF a la movilidad
electroosmótica, ε a la constante dieléctrica del medio, ζ al potencial zeta, η a la
viscosidad del medio, y q y r a la carga y al radio del analito, respectivamente.
) ( eff EOF m V Ll t μ μ + = (9) η εζ μEOF = (10) η π μ r q eff 6 = (11) 1. Variaciones en el EOF
Las diferencias en las características químicas de la superficie del capilar de sílice son uno de los factores más importantes que afectan a la reproducibilidad en cualquier modo de CE. Como se ha descrito anteriormente, a pHs superiores a 2,5, los silanoles de la pared del capilar se encuentran ionizados. El grado de ionización de la pared depende del pH de la solución acuosa que albergue el capilar [32]. Una variación de las características químicas de la superficie del capilar causa fluctuaciones en el EOF (a través de variaciones en ζ), y por tanto en el tiempo de migración de los analitos [55- 57]. Estas variaciones en la pared del capilar pueden ocurrir entre distintos capilares o entre inyecciones en el mismo capilar. El EOF entre capilares de distintos lotes puede variar más de un 5% (RSD), debido a diferencias en la composición química de la pared
[53]. Por otro lado, uno de los motivos de la irreproducibilidad del EOF entre inyecciones es la lentitud a la que la sílice se equilibra cuando se le pasa de un tampón a otro. Esta lentitud causa variaciones en el grado de ionización de la pared entre inyecciones, y por tanto, en el EOF [32]. Esto obliga a que los re-equilibrados entre inyecciones de muestras de proteínas sean, habitualmente, largos.
El EOF también puede variar debido a la adsorción de las proteínas analizadas a la superficie del capilar. Si estas proteínas no son desorbidas adecuadamente en los lavados del capilar entre inyecciones, pueden dar lugar a irreproducibilidad en los tiempos de migración. La adsorción de las proteínas a la superficie del capilar y su efecto sobre el EOF ha sido estudiada por diversos autores [7, 58, 59]. En general, cualquier proteína con una región cargada positivamente puede interactuar con la pared de sílice desnuda, pues se ha demostrado que la adsorción de proteínas está dominada por interacciones electrostáticas [7]. Esta adsorción es proporcional a la concentración de proteína inyectada [59] y afecta al valor de ζ de la zona de la pared a la que se adsorbe. En la sección I.2.2 (La columna capilar) se han descrito algunas estrategias para minimizar la adsorción de proteínas.
El acondicionamiento del capilar para obtener buenas reproducibilidades es, por tanto, clave en CZE. En general, se recomienda acondicionar el capilar antes de su primer uso con NaOH 1 M para tratar de obtener superficies similares entre capilares [53]. Es habitual que el EOF se haga más lento conforme el capilar envejece [57]. Entre inyecciones es imprescindible, especialmente si se trabaja con proteínas, realizar un lavado exhaustivo del capilar que garantice que la pared de éste se encuentre en un estado lo más parecido posible de una inyección a otra. Para el caso de las proteínas, existen diversas estrategias de lavado del capilar. Por ejemplo, es posible lavar el capilar con una disolución de NaOH, con SDS o con ambas consecutivamente. Estos lavados han de optimizarse experimentalmente en el desarrollo de cada método de separación. En ocasiones, conllevan el mismo tiempo que el propio análisis.
2. Variaciones en la temperatura de la muestra y/o del capilar
Las variaciones en la temperatura de la muestra o en la temperatura del capilar pueden afectar a la viscosidad que, como se ha descrito, influye sobre la movilidad electroforética de los analitos (ecuación 11). Este problema se ve minimizado con los
sistemas de termostatización actuales con que cuentan los equipos de CE. Sin embargo, el diseño de éstos hace que una parte del capilar (los extremos) no esté termostatizado [53].
3. Preparación del tampón y cambios del tampón durante su uso
Está descrito en la literatura cómo ligeras variaciones en el pH o la composición del tampón pueden dar lugar a cambios significativos en el tiempo de migración de los analitos, porque el pH influye en el grado de ionización de los silanoles de la pared del capilar y porque la composición del tampón afecta a la doble capa [60]. También está descrita la electrolisis del tampón de separación debido a su uso en separaciones electroforéticas [61], que se ve minimizada utilizando viales de tampón con el máximo volumen posible o renovando el tampón de separación cada cierto número de análisis.
Algunas causas de la falta de reproducibilidad en los tiempos de migración de los análisis en capilares recubiertos estáticamente
Un capilar con un recubrimiento estático puede eliminar o minimizar el EOF. En muchas ocasiones el recubrimiento tiene defectos y existen zonas del capilar que todavía pueden ionizarse y, por tanto, producirse interacciones electrostáticas entre los silanoles y las zonas de la proteína con cargas positivas. Por tanto, las variaciones en el EOF residual de los capilares recubiertos debidos a diferencias en la ionización de los silanoles libres entre inyecciones y la adsorción progresiva de proteína son dos de las principales causas de la irreproduciblidad en la CE con capilares recubiertos. Además, los recubrimientos van deteriorándose conforme el capilar envejece [62].
Estrategias para minimizar el efecto de la falta de reproducibilidad de los tiempos de migración en CE
Se han publicado distintas aproximaciones para la resolución del problema de la falta de precisión de un determinado parámetro de migración en electroforesis capilar (EC). Algunas publicaciones incluyen la comparación de distintos parámetros como el tiempo de migración, el tiempo de migración relativo al de un patrón interno, la movilidad electroforética efectiva, la movilidad electroforética aparente y la movilidad electroforética relativa a la de un patrón interno [55, 63-67]. Otros estudios hacen uso de
la movilidad electroforética efectiva de patrones conocidos para determinar la movilidad eléctroforética del compuesto de interés [56, 57]. Además, también se ha desarrollado un programa de ordenador para normalizar los tiempos de migración de los analitos en distintos análisis en los que varía el flujo electroosmótico o el voltaje aplicado. El programa normaliza electroforegramas con respecto a uno que toma como referencia. Para ello, hace falta que el electroforegrama normalizado y el de referencia cuenten con al menos dos patrones internos o picos electroforéticos correspondientes a analitos conocidos. Con estos dos picos de referencia, el programa calcula dos factores de corrección: el debido a cambios en el voltaje y el debido a variaciones en el flujo electroosmótico. Con estos factores de corrección, Reijenga et al. normalizan los tiempos de migración del resto de analitos en el electroforegrama [68]. Como puede verse, algunos de estos estudios requieren la adición a la muestra de al menos un patrón interno (PI) o de marcadores de EOF. Estos métodos, por tanto, presentan el inconveniente de tener que añadir un compuesto extraño a la muestra.
3. LA ELECTROFORESIS CAPILAR PARA EL ANÁLISIS DE