Fase I: Escalamiento del consorcio microalgal empleando medios de

microbiano.

Se realizaron inoculaciones en medio sólido (agar-agar) para luego ser traspasado a medio líquido y proceder con el escalamiento de la biomasa.

3.5.1.1 Sembrado en medio sólido (agar-agar).

Según Romo (2002), este tipo de rutina se realiza para tener en medio sólido las especies de microalgas del cepario.

Elementos y equipos:

Agar-agar granulado: 15 g/mL Algal 8mM: 16 mL/mL

Agua destilada: dependiendo de la cantidad de placas a sembrar Asa bacteriológica Placas de Petri Matraz Tapón Plancha Agitador magnético Autoclave

Preparación del material.

• Agar-agar:

a. Calentar agua destilada (utilizar plancha de calentamiento) en un matraz hasta alcanzar ebullición.

b. Agregar el agar y disolver con ayuda del agitador magnético.

c. Al observar un color amarillo transparente, meter en el autoclave a 15 lb/pul2 a 121°C por 15 minutos.

d. Antes de sacar el matraz del autoclave, es necesario abrir parcialmente la puerta, para evitar un cambio brusco de temperatura.

e. Esperar aproximadamente de 15 a 20 minutos o hasta que la mezcla se atempere.

f. Agregar algal 8 mM (16 mL/mL)

• Llenado de placas de Petri:

a. Se realiza en condiciones estériles (cerca de la llama de un mechero)

b. Se vierte un volumen de 20 mL de la mezcla dentro de la placa previamente esterilizada en el autoclave (sin pasar el borde de la placa).

c. La placa cerrada se coloca a un lado del mesón para que se solidifique la mezcla.

d. Una vez llenadas y solidificadas todas la placas se llevan a la incubadora a 30°C por 12 horas para verificar su esterilidad.

e. Descartar las placas contaminadas.

f. Las placas no contaminadas se guardan en el refrigerador.

• Procedimiento del llenado de placas de Petri:

a. Se realiza bajo condiciones estériles, bajo campana de flujo laminar o cerca de la llama del mechero bunsen.

b. Se utiliza un asa bacteriológica.

c. El aza pasa por el mechero hasta el rojo vivo.

d. Se abre la placa o tubo respectivo de donde se tomará el inoculo cerca del mechero.

e. El asa se enfría (1 seg.), para luego tomar la muestra. f. El rayado es en zig-ziag en la placa.

g. Después de descargar el asa, esta se pasa por el mechero hasta rojo vivo antes de iniciar otra siembra.

h. Se sella la placa de Petri con papel “parafilm”, colocándose de manera invertida (el lado del agar hacia la fuente de luz) en el área del cepario. i. Las condiciones de incubación son: temperatura de 30º C, fotoperíodo

luz:oscuridad 12h:12h a 4 Klux, durante 15 días o hasta observar crecimiento en la línea de siembra de las placas.

3.5.1.2 Sembrado en medio líquido.

Igualmente Romo (2002) afirma que los volúmenes que se siembran en medio liquido son variados, previo al sembrado de tubos o fiolas, debe asegurarse que el medio al cual se transferirá la microalga esté a la misma temperatura de donde se tomará el inoculo, es por ello que se recomienda previamente haber esterilizado el material. Al momento de la siembre se agrega primero el medio de cultivo y posterior a esto el inoculo. Para la adición del medio se utilizan micro pipetas automáticas con puntas ya estériles (de 100 µl ó 1 mL), las cuales se colocan en frascos de vidrio resistentes al calor y con tapadera para autoclave.

El inóculo utilizado para este tipo de medio dependerá del propósito de los mismos. Si proviene de una placa, se tomará una muestra utilizando el asa bacteriológica (previamente pasada por el mechero), luego traspasa a un tubo de ensayo con 1 mL del medio líquido. Si proviene de otro tubo, se tomará la muestra

con la micropipeta (aproximadamente 100 µl); en ambos casos agitando para que se distribuya en la columna de agua.

Cada vez que se abra un tubo o fiola, antes y después de tomar o depositar la muestra, se pasará la boca de cada uno por la llama del mechero como medida de seguridad.

3.5.1.3 Escalado del consorcio:

Una vez realizada la siembra en tubos de ensayo, se procedió al traspaso en fiolas de 250 mL (aproximadamente de 2 a 3 tubos por fiola), a su vez, se añadia el medio de cultivo para aumentar su volumen (cada 10 días), al tornase el cultivo verde oscuro (lo cual era indicativo del crecimiento celular), se traspasaba nuevamente a fiolas de 500 mL (previamente esterilizadas) y se suministra medio cada 10 días. El medio de cultivo utilizado para el escalamiento del consorcio microalgal estaba conformado por una solución de nitrofoska® (0,5mL/mL) y Algal 8 mM (16mL/mL) en agua destilada. Para asegurar un crecimiento prospero, se tomaban muestras representativas de cada fiola y se analizaban bajo el microscopio con un aumento de 40X.

3.5.1.4 Evaluación de la biomasa e identificación taxonómica del consorcio:

Para conocer la densidad celular presente en el cultivo, es necesario realizar un conteo celular del mismo, este procedimiento fue realizado como el descrito por Romo (2002).

• Cámara de Neubauer:

Presenta dos cámaras. En la cara superior del portaobjetos, se encuentran dos canales laterales y un canal central, a cuyos lados superior e inferior existen grabados dos cuadriculas de 1 mm de superficie, subdivididos a su vez en cuatro cuadriculas más fina (cuadrantes).

Procedimiento:

a. Se toman 1 mL de muestra en un tubo de ensayo.

b. Dependiendo de la densidad del cultivo se procede a diluir la muestra (factor de dilución) hasta que el número de celular por cuadrante este un rango de 30 y 300.

c. El conteo se inicia de izquierda a derecha, siguiendo la trayectoria de la flecha indicada en la figura 3.1.

d. Para halla la densidad celular se realiza un promedio del número de células contabilizadas por cuadrante, este promedio se multiplica por el factor de dilución utilizado y 10000.

Figura 3.1 Subdivisiones de la cámara de Neubauer (Romo, 2002).

La identificación del consorcio se realizó mediante observaciones de las muestra en fresco y fijadas con lugol, la identificación de los especímenes se realizó siguiendo las morfologías d escritas por Nazih, Shammas, Wang, Pereira y Hung,( 2009), Borowitzka (1986) y Novelo ( 2012).

3.5.2 Fase II: Evaluación el efecto del gasoil en el crecimiento, producción de