Para lograr ADN con la pureza y concentración adecuadas, la extracción se hizo a partir de leucocitos de sangre periférica por el método de precipitación salina (“salting-out”) (Gorodezky et al., 2000; Sambrook y Russell, 2001). Todos los materiales y reactivos fueron esterilizados previo a su utilización.
El método de la extracción de ADN se fundamenta en la lisis de eritrocitos y el lavado de células blancas para la obtención de ADN genómico, mediante la utilización de reactivos y enzimas (proteinasa K y RNasa) (Sambrook y Russell, 2001), lo que permitió la obtención del material genético. Después de la extracción, se verificó la integridad del ADN purificado por electroforesis en gel de agarosa. La amplificación del locus FSHR se realizó por medio de la técnica de PCR y la tipificación del locus por la técnica de RFLP según el método mencionado por Campagnari et al. (2002) para FSHR.
El lavado de células sanguíneas para la extracción del ADN, permitió eliminar los glóbulos rojos, de la siguiente manera: para la obtención del “paquete” de células nucleadas, se colocó en un micro tubo de 2.0 mL, (Eppendorf®, Alemania) 500 µL de sangre completa individual, al que se le adicionó 1 mL de H2O ddest (agua desionizada estéril) fría, éstos se colocaron en un mezclador de alta velocidad (Max-MixII Thermolyne®), para posteriormente centrifugar (Microcentrífuga SIGMA® 1-15 κ, USA) a 12000 rpm/10 min a 4 ºC.
El sobrenadante fue extraído utilizando puntas y pipetas Eppendorff de varios calibres. Se agregaron nuevamente 500 µl de sangre centrifugando en iguales condiciones. Se efectuaron hasta dos lavados más para obtener un paquete libre de hemoglobina. El paquete se resuspendió en una solución de lisis (10mM Tris-HCl pH8, 400mM NaCl, 20mM EDTA, 0.5% SDS), se mezcló y se dejó en reposo por 10 min a temperatura ambiente.
La solución de lisis rompe las paredes celulares para obtener el ADN, el cual sale junto con todos los componentes celulares. Se añadió RNAsa [f] 15 µg/ml (PROMEGA® USA); y se agregó 1 µL/ml e incubó en un horno con agitación (BOEKEL Scientific® USA) a 37 ºC/1 h; posteriormente se añadió proteinasa K (PROMEGA®, USA) [f] de 70 µg/ml de los cuales se adicionó 1.75µL/ml, se incubó toda la noche a 55 ºC. Para la precipitación de
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las proteínas, se adicionó NaCl [f] 2M (Técnica Química Méx) al sobrenadante del último lavado, se mezcló por 15 seg y centrífugó a 12000 rpm/10 min a 4 ºC. El NaCl permite que se precipiten todos los desechos y que el ADN quede suspendido. Posteriormente, sin arrastrar el paquete de proteínas, se transfirió el sobrenadante a otro tubo, y se adicionó 750 µL de isopropanol frío (PROMEGA®, USA). Se agitó hasta precipitar el ADN, dejando en reposo por 30 min en baño de hielo, a continuación, se centrifugó a 12000 rpm/10 min/4 ºC. Para obtener el paquete de ADN, se eliminó el sobrenadante. El isopropanol frío alinea el ADN y permite que se desprendan los hidróxidos y queden únicamente los nucleótidos que forman el ADN.
Se eliminaron totalmente las sales del pellet de ADN precipitado, lavando dos veces el ADN con 500 µl de etanol al 70% (ALYT- reactivos analíticos), centrifugando a 12000g/10 min/4°C y decantando el sobrenadante. El etanol se utiliza para enjuagar el ADN. Se eliminó la totalidad del etanol en una centrifuga de evaporación al vacío a 55°C durante 10 min. Posteriormente, el ADN se rehidrató resuspendiendolo en 100 µL de agua destilada, mezclando cuidadosamente con la punta de una pipeta y se congeló a -20°C hasta su análisis (Gorodezky et al., 2000; Sambrook y Russell, 2001).
10.3 Integridad de ADN
Para confirmar que las muestras de ADN poseían condiciones adecuadas para la amplificación por PCR, se realizó electroforesis en gel de agarosa (PROMEGA®, USA) al 1% para lo cual se utilizó TAE al 1X (44.5mM Tris-HCl, pH 8.0; 44.5mM ácido bórico; 1mM EDTA) como buffer de corrida, teñido con bromuro de Etidio (PROMEGA®, USA) 1 µL [0.5 mg/ml], se usó un marcador DNA-λ de peso molecular alto (PROMEGA®, USA) y 3 µL ADN por 20 min a 60 voltios (V) (Sistema de Electroforesis Thermo Electron Corporation® USA) Tabla 1.
Tabla 1. Método de Integridad de ADN Método de integridad de ADN
Pozo 1 Pozos sucesivos (2-16)
Marcador Lambda 3 µL ---
Blue Orange 2 µL 2 µL
ADN --- 3 µL
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Los tres elementos se mezclaron por pipeteo antes de agregar al pozo, las muestras se corrieron aproximadamente 20 min. La integridad de cada banda y su identificación se revisaron en un transiluminador de luz UV (Spectroline® USA), la imagen se analizó mediante un sistema de documentación automática de geles Gene-Snap (Spectronic Corporation® USA).
La molécula de ADN tiene carga negativa y al colocarse en un campo eléctrico (gel en cámara de electroforesis) tiende a moverse en dirección al polo positivo del campo, las moléculas más pequeñas se mueven más rápido que las más grandes y esto permite separar fragmentos de diferente tamaño y peso.
El bromuro de etidio con que se tiñen los geles (0.5µg/ml) se intercala entre las bases de los ácidos nucleicos y produce fluorescencia, que al ser iluminada con luz ultravioleta (UV) fluoresce y señala los sitios del gel donde hay fragmentos de ADN visualizandose en bandas (Sambrok y Rousell 2001). Se utilizó cámara horizontal de electroforesis marca (SCIENTIFIC CO) con portageles de 8.5 cm ancho x 18.5 cm largo; y peines de la misma marca de 1 mm de ancho con 16 posiciones.
10.4 Cuantificación de ADN
Para conocer la concentración de ADN cada una de las muestras analizadas, se cuantificó por espectrofotometría de UV/Luz visible, (D.O. 260/280) (Helios Alpha UV-Vis spectrophotometer, Unicam®), el cálculo del contenido de ADN se basa en el concepto de que una unidad absorvida a 260 nm (Una DO de 1) equivale a a 50 µg/ml de una doble cadena de ADN (Sambrok y Rousell 2001). Las longitudes de onda utilizadas por el espectrofotómetro son 260 nm y 280 nm (Densidad óptica: OD260:OD280) y una tasa (cociente) entre 1.5 y 2.0 lo que corresponde a un rango de peso molecular entre 20 y 100 kb (Sambrook y Rousell, 2001).
10.5 Técnica de espectrofotometría
Se tomó como referencia el resultado de la longitud de onda a 260 nm y el resultado se multiplicó x 200 (dilución), x 50 (densidad óptica 50µg/ml) y x 10 (conversión de mg a ng). Este resultado indicó la cantidad de ADN que se tuvo por muestra y qué cantidad se debió tomar para correr la PCR. El ADN se calentó a temperatura de 30 ºC durante 30
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min y posteriormente se realizó una dilución 1:200, se colocó en un tubo eppendorff de 2 ml, 5 µl de ADN + 995 µl de agua desionizada. Como blanco se utilizó agua desionizada. Las lecturas se hicieron por triplicado. Los resultados de cada muestra se ajustaron a una reacción final de 100ng/ µl por cada alícuota a amplificar por PCR (Marson et al., 2005).
10.6 Protocolo para PCR
1. Para la amplificación por PCR del locus de FSHR, las concentraciones de todas las muestras se ajustaron a 100 ng/µL. Basados en el estudio de Marson et al. (2005), se seleccionaron los siguientes marcadores:
F5´-AGTTCTTGGCTAAATGTCTTAGGGGG-3´
R5´-CTGCCTCCCTCAAGGTGCCCCT-3´,
Los cuales corresponden a un segmento del gen de 306 pb, de Bos taurus (Gen Bank L22319), utilizando la temperatura y ciclos de tiempo reportados por Campagnari (2002), para FSHR (Tabla 2).
Tabla 2. Protocolo de amplificación de FSHR
Locus Tipo RFLP4
Cromosoma1 Exón Secuencia (5’-3’) Ta
(ºC) Referencia FSHR5 AluI 11 10 F2: CTGCCTCCCTCAAGGTGCCCCTC R3 :AGTTCTTGGCTAAATGTCTTAGGGGG 58 Houde et al., 1994
1Cromosoma; 2(F) (hacia delante) dirección (5’-3’) 3R (reversa) dirección (3’-5’) 4 RFLP: Restriction fragment length polymorphism. 5FSHR: Receptor de la hormona folículo estimulante.
En la Figura 15 se muestra el fragmento de 306 pb a visualizar por PCR en gel de agarosa al 1.8%. Los cuadros en rojo marcan el inicio y final de un segmento del FSHR bovino de 306pb correspondiente a las membranas seis y siete del exón 10. Los oligonucleotidos fueron tomados del estudio de Marson et al. (2005).