Fasinas (PhaP)

En todos los géneros productores de PHA estudiados se encontraron proteínas de bajo peso molecular denominadas fasinas, las cuales se unen a los gránulos citoplasmáticos de PHA y regulan positivamente la síntesis del polímero (Pieper-Fürst et al., 1995; Wieczorek et al., 1995); (Pötter y Steinbüchel, 2005). Las fasinas son las proteínas mayoritarias presentes en los gránulos de PHA. Las mismas generalmente contienen un dominio hidrofóbico que se asocia a la superficie de los gránulos de PHA, y otro dominio hidrofílico que está expuesto hacia el citoplasma celular. Los genes correspondientes a estas proteínas se denominan normalmente phaP (Pieper-Fürst et al., 1995; Steinbuchel et al., 1995; Wieczorek et al., 1995).

Los primeros estudios con la proteína PhaP fueron realizados por Steinbüchel y colaboradores en C. necator en el año 1995 (Wieczorek et al., 1995). Se aislaron 35 mutantes “leaky” en la producción de PHB (generadas por Tn5), las cuales producían menores cantidades de PHB que la cepa salvaje. Se encontró un fragmento geonómico de 5 kb que complementaba estas mutantes. Dentro de este fragmento se encontró un marco de lectura abierto (ORF) de 687 pb, el cual se denomino phaP, que codifica una proteína de 24 kDa. Esta proteína fue solubilizada a partir de gránulos de PHB, purificada, y utilizada para la producción de anticuerpos específicos. Se confirmó la presencia de esta proteína en los gránulos de PHB mediante ensayos de inmunomicroscopía electrónica. PhaP puede representar hasta un 5% de

las proteínas celulares totales, y es la proteína predominante en los gránulos. En experimentos realizados en C. necator se observaron solamente uno o dos gránulos de gran tamaño en células con el gen phaP delecionado, mientras que en células salvajes se forman varios gránulos de PHB de menor tamaño (Wieczorek et al., 1995).

Se han propuesto tres mecanismos para explicar la función regulatoria de las fasinas. En el primero, las fasinas incrementarían la producción de PHA uniéndose a los gránulos, aumentando de esta manera su relación superficie/ volumen, estabilizándolos y evitando que se unan entre sí (Steinbuchel et al., 1995; Wieczorek et al., 1995). En segundo lugar, las fasinas podrían interactuar directamente con la PHA sintasa, activando la síntesis de PHA (Wieczorek et al., 1995). El tercer mecanismo propone que las fasinas promueven la producción del polímero indirectamente, evitando que otras proteínas se unan a los gránulos (Wieczorek et al., 1995; Maehara et al., 1999).

Con el fin de analizar el rol de PhaP en la síntesis de PHB bajo distintas condiciones de cultivo se analizaron mutantes de C. necator con el gen phaP delecionado (York et al., 2001b). Se observó una disminución del 50% en la producción de PHB, al comparar los valores con la cepa salvaje, bajo condiciones de baja, media y alta acumulación del polímero. Además, se observó que los niveles de PhaP aumentan de manera lineal con los niveles de PHB. Estos resultados son consistentes con los primeros dos modelos acerca de cómo sería el mecanismo de acción de las fasinas. PhaP promovería la síntesis de PHB regulando la relación superficie/ volumen de los gránulos de PHB, e interactuando con la PHA sintasa.

Estudios posteriores realizados también en C. necator demostraron que la acumulación de PhaP es dependiente de la producción de PHB de la célula (York et al., 2001a). Se realizaron ensayos de acumulación de PHB y PhaP en células con el gen de la PHA sintasa delecionado (es decir, bacterias incapaces de producir PHB). Estas células fueron incapaces de producir PhaP. También se realizaron ensayos de Western blot contra PhaP en distintas etapas en la acumulación de PHB, de manera de estudiar como es la regulación de la síntesis de PhaP. Se realizaron cultivos celulares mixtos, donde la mitad de las células tenían el gen phaP delecionado y los genes estructurales pha intactos, y la otra mitad tenían el gen de la PHA sintasa delecionado, pero el phaP salvaje. En estos cultivos no se detectó la presencia de PhaP, lo que sugeriría que la producción de PhaP se ve regulada por la presencia de PHB en esa misma célula y no por otros factores, como podrían ser metabolitos extracelulares presentes en el sobrenadante de los cultivos (York et al., 2001a).

En C. necator se caracterizaron cuatro fasinas: PhaP1-4 (Pötter et al., 2004), siendo la PhaP1 la que describió por primera vez (Wieczorek et al., 1995). Se estudió la expresión de los genes phaP durante la producción de PHB mediante qRT-PCR, y se observó que los cuatro

genes son transcriptos. Además, se observó que PhaP1, PhaP3 y PhaP4 se unen a gránulos de PHB. A pesar de que PhaP2 no pudo ser encontrada en los gránulos, estudios realizados in vitro demostraron que PhaP2 era capaz de unirse a gránulos del polímero (Pötter et al., 2004).

También se estudió la presencia de PhaP en bacterias productoras de PHAMCL. La expresión de PhaP de C. necator aumentó la actividad de la PHA sintasa de clase I I de Pseudomonas aeruginosa (Qi et al., 2000). Además, se realizaron estudios en Rhodococcus ruber, productora de PHASCL, en los que se encontró que la región que se ancla a los gránulos de PHA se halla en el extremo carboxi-terminal. Si se deleciona esta parte de la proteína, la misma pierde la capacidad de unirse a los gránulos (Pieper-Fürst et al., 1995). Los gránulos de PHA también pueden ser generados in vitro incubando la PHA sintasa y un sustrato adecuado. Se observó que la adición de PhaP acelera la producción del polímero (Jossek y Steinbuchel, 1998).

Aplicaciones biotecnológicas de las fasinas

Se han descripto varias aplicaciones biotecnológicas aprovechando la afinidad de PhaP a los gránulos de PHB. Se ha estudiado la posible utilización de PhaP para mejorar los rendimientos obtenidos en la purificación de proteínas recombinantes. Para ello se ha diseñado una cepa de C. necator que contiene la proteína GFP (green fluorescent protein de Aequorea victoria) fusionada a PhaP y a una inteína (Barnard et al., 2005). Las inteínas son proteínas auto-clivables, las cuales son ampliamente utilizadas en la producción y purificación de proteínas recombinantes (Derbyshire et al., 1997; Wood et al., 1999). Al purificar los gránulos de PHB mediante lisis celular y centrifugación diferencial, se obtiene la proteína GFP fusionada a PhaP. La misma es luego separada de la fasina mediante la adición de tioles que activan a la inteína, liberando de esta manera a la GFP. Estudios similares fueron realizados en E. coli recombinante productora de PHB y PhaP para la producción de distintos tipos de proteínas recombinantes (Banki et al., 2005; Yao et al., 2008).