Formación de biofilms multiespecie

Una vez establecida la supervivencia de las bacterias patógenas en el jugo de manzana y conocidas las interacciones bacteria-levadura en suspensión, se ensayaron las casuísticas que se mencionan a continuación:

2.5.1. Ensayos de adhesión levadura-bacteria

Para los ensayos de colonización se utilizó como sustrato de adhesión cupones de acero inoxidable AISI 304 L y como matriz biológica suspensiones celulares ajustadas en jugo de manzana de 12 °Brix de Candida tropicalis, Candida krusei, Escherichia coli

O157:H7 (EDL 933) y Salmonella sp.

Para determinar el efecto de las relaciones inter-específicas levadura/bacteria en el proceso de adhesión a superficies como el AI, diferentes condiciones fueron ensayadas: a) Co-adhesión levadura/bacteria, b) Incorporación de bacterias a un biofilm pre- formado de levaduras y c) Ensayo de cultivos con sobrenadantes de levaduras y bacterias.

Para poder observar el efecto de dichas condiciones, se analizó el comportamiento de cada especie por separado, como referencia. Para esto, las suspensiones celulares ajustadas de C. tropicalis, C. krusei, E. coli O157:H7 y Salmonella sp. fueron

preparadas como se detalla en la sección 2.1 y los ensayos de adhesión se realizaron siguiendo el protocolo descrito en la sección 2.6 de Capítulo 13.

Las suspensiones bacterianas en cada uno de los ensayos detallados en esta sección se realizaron con células pre-adaptadas 4 horas en jugo de manzana de 12 ºBrix a 25 ± 1 ºC tal como se detalla en la Sección 2.3.

En general, para cada una de las situaciones se pusieron en contacto suspensiones celulares ajustadas con segmentos de AI en cajas de Petri subdivididas como se detalla en la sección 2.6 del Capítulo 1 (―Ensayos de adhesión sobre acero inoxidable‖). Al cabo de cada tiempo los segmentos fueron cuidadosamente removidos, lavados dos veces con 5 ml de PBS durante 1 - 2 minutos cada vez bajo agitación (50 rpm) para remover las células débilmente adheridas y/o no adheridas.

En todos los casos, los pares superficie/suspensión fueron cultivados a 25 ± 1 ºC durante 24 horas bajo condiciones estáticas.

Al cabo de cada ensayo se destinaron segmentos de AI para su análisis por microscopia de epiflourescencia, SEM y recuentos. Para los recuentos de células viables se colocaron los segmentos en tubos de ensayo con perlas de vidrio y se los agitó a máxima velocidad durante 3 minutos con vórtex (con la finalidad de desprender los microorganismos adheridos a la superficie). Las correspondientes diluciones seriadas se utilizaron para realizar los recuentos en agar YGC en el caso de Candida tropicalis y

Candida krusei, por técnica de agotamiento en superficie y agar TSA para E. coli

O157:H7 y Salmonella sp., por técnica de agar volcado. Las placas fueron incubadas a 25 ± 1 ºC y 35 ± 1 ºC, respectivamente durante 24 a 48 horas. Los resultados fueron expresados como UFC/ cm2.

Los diferentes escenarios analizados explican en detalle a continuación:

Co-adhesión levadura/bacteria

El efecto neto de la interacción directa levadura/bacteria se ensayó colocando volúmenes iguales de las suspensiones celulares ajustadas de cada una de las especies,

C. tropicalis y C. krusei (106 células/ml), y E. coli O157:H7 y Salmonella sp. (108

células/ml). Cada uno de los pares levadura/bacteria (C. tropicalis/E. coli O157:H7, C.

tropicalis/Salmonella sp, C. krusei/E. coli O157:H7 y C. krusei/Salmonella sp.) fueron

cultivados durante 24 horas a 25 ± 1 ºC.

Biofilm pre-formado de levaduras

Un escenario potencial que pueden enfrentar las bacterias patógenas cuando ingresan a las plantas procesadoras de jugos de fruta es la presencia de una superficie ya colonizada, en este caso, por levaduras. En primer lugar, se pusieron en contacto los segmentos de AI con suspensiones celulares ajustadas de C. tropicalis y C. krusei

durante 8 horas a 25 ± 1 ºC, luego fueron removidos y lavados para remover las células débilmente adheridas y/o no adheridas. Posteriormente los mismos segmentos fueron puestos en contacto con suspensiones celulares ajustadas de las bacterias patógenas. Las mismas fueron incubadas a 25 ± 1 ºC durante 16 horas (completando las 24 horas del ensayo).

Ensayo con sobrenadantes

La presencia de posibles moléculas inhibidoras con actividad antimicrobiana se ensayó utilizando sobrenadantes libres de células. Para la obtención de los mismos cada especie fue cultivada como se detalla en la Sección 2.14 y los sobrenadantes fueron colectados por centrifugación a 5000 x g por 10 minutos y luego esterilizados por microfiltración utilizando membranas de 0,45 µm de tamaño de poro (Metricel®Grid, GelmanSciences, MI, EE.UU.). El medio resultante contiene todas las moléculas liberadas durante el crecimiento celular.

Para observar el efecto de los sobrenadante libres de células sobre la adhesión de los microorganismos, se colocaron volúmenes iguales de (i) suspensiones celulares ajustadas de cada especie de levadura y (ii) sobrenadantes de bacterias patógenas. El caso inverso también se ensayó, donde las suspensiones ajustadas de las bacterias patógenas se expusieron a sobrenadantes de las levaduras. En todos los casos la relación suspensión ajustada:sobrenadante fue de 1:1.

2.6 Análisis estadístico

En los casos en donde se realizaron recuentos las UFC fueron transformadas a unidades logarítmicas quedando expresadas como Log UFC/cm2, para aproximarla a la hipótesis de distribución normal.

En todos los casos los análisis se realizaron por triplicado bajo las mismas condiciones en dos ensayos independientes y los resultados se expresaron como Media y Desvío Estándar (Media ± DE).

Se realizó un test t-Student cuando fue apropiado para la comparación de medias y se consideraron como resultados estadísticamente significativos aquellos con un nivel de confianza igual o mayor al 95 % (p < 0,05).

2 3 4 5 6 7 8 9 0 4 8 12 16 20 24 Lo g UFC/m l Tiempo (hs) 3. RESULTADOS

3.1 Ensayos de supervivencia de bacterias patógenas en jugo de manzana

En la Figura 3.1 se muestra la supervivencia de Escherichia coli O157:H7 y Salmonella

sp. incubadas a 25 °C durante 24 horas en jugo de manzana de 12 °Brix (pH 4,3 ± 0,2). La población de células viables de E. coli O157:H7 sufrió una reducción significativa (p< 0,05) cuando fue enfrentada a un medio ácido como lo es el jugo de manzana, independientemente de una previa adaptación. En cuanto a la población de células ácido adaptadas (AA) de E. coli O157: H7, la misma disminuyó 2,90 Log UFC/ml a las 18 horas y 2,72 Log UFC/ml a las 24 horas, mientras que la disminución de las células no adaptadas (NA) fue de 4,7 Log UFC/ml a las 18 horas y 4,6 Log UFC/ml a las 24 horas. Por otro lado, la supervivencia al ácido de Salmonella sp. no dependió de una previa exposición a pH ácido, no encontrándose diferencias significativas entre AA y NA a las 24 horas de incubación en jugo de manzana. Los recuentos alcanzados para el caso de

Salmonella sp. fueron de 8,0 (AA) y 8,4 Log UFC/ml (NA), al cabo de 24 horas. A

diferencia de E. coli O157:H7, Salmonella sp. no sólo superó la condición ácida sino que también aumentó su número rápidamente entre las 4 y 18 horas de incubación.