Formato directo o de anticuerpo inmovilizado

En este formato y como se ilustra en la Figura 1.13, el hapteno se acopla covalentemente a una enzima (trazador enzimático), y es el anticuerpo especifico el que se inmoviliza sobre la placa. El anticuerpo puede ser absorbido bien de manera directa (adsorción pasiva) o bien de manera indirecta, por ejemplo, mediante el empleo de un anticuerpo de captura o proteínas G o A. Esta última estrategia puede resultar interesante para conseguir revertir posibles modificaciones en el funcionamiento del anticuerpo como consecuencia de su inmovilización directa

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Figura 1.13. Representación esquemática del desarrollo de un ensayo ELISA directo (anticuerpo inmovilizado)

En este formato, en la etapa competitiva se añade al pocillo el analito y el trazador enzimático. Analito y trazador compiten por los sitios de unión del anticuerpo inmovilizado; en función de la concentración de analito libre presente en la muestra, quedará finalmente una determinada cantidad de conjugado enzimático unida al anticuerpo. En este caso ya no se requiere de un segundo reactivo para generar la señal, puesto que el propio trazador enzimático permitirá obtenerla tras la adición del sustrato adecuado.

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1.5.4.2 Optimización de la sensibilidad del ensayo

En base al equilibrio dinámico establecido entre el anticuerpo, el analito libre y la

especie competidora, la sensibilidad del ensayo (estimada a partir del valor de IC50

de la curva de inhibición) dependerá de la constante de afinidad del anticuerpo hacia ambos reactivos. Por lo tanto, sería en principio posible alterar el equilibrio de la reacción para aumentar la afinidad aparente del anticuerpo hacia el analito libre, es decir, aumentar la sensibilidad al forzar el desplazamiento del equilibrio hacia la formación del complejo anticuerpo-analito, a través de la modificación de algunos

de los parámetros característicos de un inmunoensayo.114 _{Sin embargo, el recurso}

que más posibilidades ofrece para mejorar el ensayo es sin duda la heterología. El concepto de heterología viene determinado por la naturaleza del hapteno competidor que interviene en el inmunoensayo. Así, se define como ensayo homólogo a aquel que utiliza un conjugado (formato indirecto) o trazador enzimático (formato directo) homólogo, esto es, un conjugado constituido por el mismo hapteno que el que se utilizó en la inmunización. Por el contrario, un ensayo heterólogo es aquel en el que el hapteno utilizado en la preparación de los conjugados competidores es estructuralmente distinto del hapteno inmunizante. De esta forma, a través del uso de un competidor heterólogo para el cual el anticuerpo presenta una afinidad ligeramente menor de la que tiene por el conjugado homólogo, se consigue desplazar el equilibrio hacia la formación del complejo anticuerpo–analito, es decir, aumentar la afinidad aparente del anticuerpo hacia el analito libre, lo que se traduce en una mejora de la sensibilidad de ensayo

(Figura 1.14).115,116

En principio, cuanto más diferente sea el hapteno competidor, menor será la afinidad del anticuerpo hacia él y más sensible puede ser el ensayo. Sin embargo, si dicha afinidad fuese excesivamente baja, el conjugado podría no ser reconocido, por lo que no se obtendría señal y, por tanto, no existiría ensayo. Dado que, al igual que ocurre con el hapteno inmunizante, predecir la estructura ideal del hapteno competidor no es sencillo, es recomendable explorar diversas aproximaciones sintéticas que permitan obtener haptenos heterólogos.

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Figura 1.14. Modificación del equilibrio de reconocimiento de un anticuerpo (Ab) hacia un analito (An) en la etapa de competición de un ELISA competitivo al realizar el ensayo con un conjugado heterólogo (Het)

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2.

OBJETIVOS

El presente trabajo se enmarca dentro de la línea de investigación denominada “Síntesis de moléculas con aplicaciones biotecnológicas y analíticas”, adscrita al Departamento de Química Orgánica de la Universidad de Valencia, y de la línea de investigación “Inmunotecnología analítica de alimentos”, adscrita al Departamento de Biotecnología del Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos. Dentro de estas líneas de investigación, el propósito principal de esta Tesis Doctoral es la síntesis de haptenos y bioconjugados de anatoxina-a para el desarrollo de métodos inmunoquímicos para esta biotoxina.

Este estudio, a tenor del objetivo indicado, pretende obtener como resultado más destacable anticuerpos monoclonales de elevada afinidad y especificidad hacia anatoxina-a como inmunorreactivos clave para el desarrollo de un método analítico. Para ello, será necesario conseguir una serie de objetivos particulares que se enumeran a continuación:

1. Obtener por síntesis química una colección de análogos estructurales funcionalizados de anatoxina-a (haptenos) que incorporen un brazo espaciador por diferentes posiciones de la molécula de interés, manteniendo la integridad estructural de la misma al objeto de asegurarla mejor exposición del analito al sistema inmune del animal inmunizado. Dentro de este contexto sintético, adicionalmente se pretende:

1.1. Sintetizar un hapteno para anatoxina-a derivatizada como estrategia alternativa para la obtención de anticuerpos analíticamente útiles para esta cianotoxina.

1.2. Obtener por síntesis química (±)-anatoxina-a y lograr la purificación cromatográfica de los dos enantiómeros para ser empleados como patrones en el desarrollo de los métodos analíticos.

2. Conjugar los haptenos a diferentes proteínas portadoras y/o enzimas para generar una colección de bioconjugados proteicos necesarios tanto para el proceso de inmunización (bioconjugados inmunizantes) como para los ensayos ELISA (bioconjugados de ensayo) en diferentes formatos.

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producir anticuerpos monoclonales mediante la tecnología de generación de hibridomas.

4. Caracterizar los anticuerpos monoclonales obtenidos, en términos de afinidad y especificidad, empleando ensayos tipo ELISA competitivos en formato de conjugado inmovilizado (indirecto) y de anticuerpo inmovilizado (directo).

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3.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN