Formulación de Modelos Cinéticos

La construcción de un modelo cinético requiere cinco elementos clave: estequiometría, datos de cinética enzimática, datos termodinámicos, datos de actividad enzimática máxima y otros parámetros de modelación.

En primer lugar, la estequiometría define el número y la naturaleza de todos los reactantes y productos que participan en una reacción bioquímica específica; y describe como las reacciones están conectadas entre sí. Hoy en día, este punto no es difícil de abordar pues se ha podido caracterizar completamente el metabolismo y se encuentran disponibles redes metabólicas a escala genómica de un número creciente de organismos (Palsson, 2006).

Por su parte, los datos de cinética enzimática incluyen las leyes de velocidad de las enzimas y las constantes asociadas (Michaelis- Menten, inhibición, activación, y otras). La búsqueda de información a partir de literatura es una tarea ardua que requiere un esfuerzo y tiempo considerables. Sin embargo, en la actualidad existen bases de datos disponibles en internet como BRENDA (http://www.brenda-enzymes.org; Schomburg et al., 2004) o SABIO-RK (http://sabio.villa-bosch.de; Krebs et al., 2007), entre otras que facilitan en gran medida este proceso. En el caso que los datos cinéticos para una enzima en particular de un determinado organismo no se encuentren disponibles, se debe recurrir a datos de especies cercanamente relacionadas.

Idealmente, los parámetros cinéticos deberían ser determinados en condiciones que asemejan la situación in vivo. Sin embargo, históricamente, los ensayos cinéticos no se han realizado de esta forma; de hecho, los mecanismos enzimáticos en general han sido investigados en condiciones óptimas de actividad enzimática en términos de pH y fuerza iónica, entre otros. Para facilitar la estandarización y la integración de los datos, Van Eunen et al. (2010) desarrolló un set de condiciones estándares para medir actividad enzimática y realizar ensayos cinéticos en levaduras. Para ello, se requirió la determinación del pH citosólico y las concentraciones de calcio, sodio, potasio, fósforo,

azufre, y magnesio. Esta información, en conjunto con datos de literatura, fue utilizada para formular una solución tampón (buffer) similar a las condiciones in vivo, experimentalmente factible (Rohwer, 2012). Además, bajo el auspicio del Instituto Beilstein en Alemania, se creó la Comisión STRENDA (http://www.beilstein- institut.de/en/projects/strenda) que promueve el desarrollo de una plataforma de búsqueda y almacenamiento de datos enzimáticos funcionales de libre acceso, en línea. Con este fin, la Comisión fomenta un sistema estandarizado de reporte de datos enzimáticos, que busca facilitar a la comunidad científica la interpretación, evaluación y reproducción de los análisis de enzimología.

En relación a los datos termodinámicos, cabe destacar que, en principio, todas las reacciones catalizadas por enzimas son reversibles, y el grado de reversibilidad debe ser explicitado adecuadamente en los modelos cinéticos. Afortunadamente, se han realizado grandes avances en términos de recolectar los datos de constantes de equilibrio (o de las constantes de energía libre de Gibbs estándar de las reacciones) en base de datos de termodinámica de reacciones catalizadas por enzimas (http://xpdb.nist.gov/enzyme_thermodynamics;Goldberg et al., 2004) y en el cálculo de los cambios de energía libre estándar para reacciones bioquímicas (Alberty, 2006).

En cuanto a los datos de actividad enzimática máxima, la velocidad máxima es incorporada en las leyes de velocidad de cinética enzimática directamente o como un producto de la concentración enzimática y la constante de velocidad catalítica (kcat). Dado que la expresión de los genes (y, como consecuencia, el nivel de enzimas) depende de las condiciones fisiológicas, estos datos tienen que ser medidos directamente en la muestra biológica para la cual el modelo se va a construir, y rara vez son transferibles de un laboratorio a otro. Más aún, los niveles de actividad enzimática son tejido y organismo específicos (Rohwer, 2012). Cabe mencionar que, durante la última década, se ha desarrollado aplicaciones para medir múltiples actividades enzimáticas a gran escala con una plataforma robótica (Gibon et al., 2004), obteniéndose una correcta correlación (R2 = 0.592) entre los niveles de proteína estimados a partir de las

actividades enzimáticas determinadas experimentalmente y los valores de kcat publicados, por un lado; y los resultados de proteómica cuantitativa, utilizando el índice de abundancia de proteínas emPAI, por el otro (Piques et al., 2009). Por lo tanto, hoy en día es posible obtener experimentalmente estos datos en sistemas biológicos, aunque su desarrollo es de alto costo.

Finalmente, también se debe considerar otros parámetros de modelación, tales como la concentración de metabolitos externos - que son incorporados como parámetros fijos en el modelo - y la concentración inicial de todas las variables del modelo. Estos datos pueden ser obtenidos de experimentos de metabolómica, ensayos directos y, en algunos casos, a partir de la literatura.

Una vez que están disponibles todos estos datos, se puede construir el modelo cinético y luego integrar el sistema de ecuaciones diferenciales ordinarias (EDOs) para obtener la evolución temporal de la concentración de los metabolitos en estudio.

A continuación, para evaluar la calidad del modelo, éste debe ser validado:

 En primer lugar, es necesario comprobar la consistencia interna del modelo; por ejemplo, asegurándose de que no hay reacciones que puedan generar un flujo de estado estacionario cuando los metabolitos externos no están presentes.

 Luego, los resultados de la simulación deben ser comparados con un set de datos independiente de los que fueron usados para la construcción del modelo. Por ejemplo, los datos de validación pueden incluir mediciones de flujos o concentraciones de metabolitos en una muestra biológica del organismo en estudio, bajo un estado fisiológico diferente.

Esta estrategia para la construcción de modelos, denominada bottom-up, no es siempre factible, debido a que la cantidad de datos disponibles puede ser insuficiente para determinar todos los parámetros del modelo (Rohwer, 2012). En ese caso, los

parámetros del modelo pueden ser estimados mediante una aproximación top-down, en la cual se ajustan estos valores iterativamente en una rutina de optimización hasta que los resultados de simulación (flujos o concentraciones) coinciden con los valores determinados experimentalmente, usando una métrica particular (Ashyraliyev et al., 2009; Cedersund & Roll, 2009).