Fosforilación del complejo entrecruzado con DMS y DTBP

y RR468 de forma covalente pero permitiendo una pequeña libertad de movimientos, para lo cual se utilizó una molécula entrecruzadora homobifuncional como dimetil suberimidato (DMS), que inserta un brazo espaciador de 11,9 Å, superior a la distancia de 2 Å del enlace covalente CYS- CYS. DMS contiene un enlace imidoester que reacciona con aminas primarias entre pH 8-9 para formar un enlace amidina estable, de forma que puede servir como conector entre dos proteínas que contengan residuos de Lys. Para comprobar que la autofosforilación de HK853-CD entrecruzada con RR468 era posible, utilizamos igualmente los mutantes RR-D53A y RR-K105A.

En primer lugar, comprobamos que DMS era un buen entrecruzador. En la Figura 54A, se muestra el entrecruzamiento de HK853-CD y RR468 después de

una incubación de 3 h con DMS donde puede observarse la aparición de la banda correspondiente al complejo entrecruzado. Como cabría esperar, la cantidad de complejo entrecruzado formada es menor que la del dímero de HK853-CD, especie fuertemente unida.

Cuando las especies entrecruzadas (HK853-CD:RR468, HK853-CD:RR- D53A y HK853-CD:RR-K105A) se someten a fosforilación, (Figura 54B) no se observa fosforilación del complejo entrecruzado HK853-CD:RR468, ya que la fosfotransferencia es muy rápida, pero sí se observa fosforilación del complejo entrecruzado HK853-CD:RR-D53A a los 30 min de incubación, lo que indica claramente que si es posible que HK853-CD se autofosforile cuando se encuentre unida a RR468. En el caso del complejo entrecruzado HK853-CD:RR- K105A se observa una débil fosforilación, relacionada con una actividad remanente de fosfotransferencia presente en este mutante.

Figura 54. Ensayo de entrecruzamiento del complejo HK853-CD:RR468 con DMS y

su fosforilación. En A se muestra en el gel SDS-PAGE el resultado del

entrecruzamiento con DMS (banda HK853-CD sin DMS, HK853-CD + 2 mg/ml DMS y HK853-CD+RR468 + 2mg/ml DMS). En B se muestra el gel autorradioagrafiado resultado de la fosforilación con [γ-32_{P]ATP de las muestras entrecruzadas con DMS}

(HK853-CD entrecruzada con RR468 silvestre (RRwt), RR468 (D53A) y RR468 (K105A)).

Cada una de las muestras fue fosforilada durante 1 y 30 min.

Para comprobar que realmente la fosforilación del complejo entrecruzado HK853-CD:RR-D53A provenía de la autofosforilación de HK853-CD, era necesario cortar dicha banda y revertir el entrecruzamiento. Sin embargo, la

1’ 30’ 1’ 30’ 1’ 30’ K105A RRwt D53A HK HK + DMS HK+RR + DMS B SDS-PAGE + [γ-32P] ATP A SDS-PAGE M 45,0 66,2 35,0 116.0 ► HK853-CD ► HK853-CD:RR468 ► (HK853-CD)2 ► HK853-CD~P ► HK853-CD:RR468~P ► _(HK853-CD) 2~P

reacción con DMS es reversible a pH > 10, tratamiento que haría inestable a la fosfoproteína, por lo que decidimos utilizar una molécula análoga a DMS, denominada dimetil-3-3'-ditiobispropionimidato (DTBP), que contiene un puente disulfuro en la cadena hidrocarbonada que permite hacer reversible el entrecruzamiento añadiendo un agente reductor como β-mercaptoetanol o ditiotreitol (DTT) (Figura 21, Apartado 3.13.2).

El entrecruzamiento con DTBP mostró un rendimiento de complejo entrecruzado menor que el obtenido con DMS (Figura 55A), pero suficiente para realizar el ensayo de fosforilación. Como se puede observar en la Figura 55B, el resultado del gel autoradiografiado es similar al obtenido con DMS. Como era de esperar, no se observa fosforilación para el complejo entrecruzado HK853- CD:RR468. Por otra parte, la banda correspondiente al complejo entrecruzado HK853-CD:RR-D53A está fosforilada y apenas hay una inapreciable fosforilación del complejo entrecruzado HK853-CD:RR-K105A. Para comprobar que en las bandas entrecruzadas la fosforilación correspondía a HK853-CD, se cortaron en el gel autoradioagrafiado las bandas correspondientes al complejo entrecruzado HK853-CD:RR-D53A (1), al complejo entrecruzado HK853-CD:RR-K105A (2) y se sometieron a SDS-PAGE con β-mercaptoetanol. Como control cortamos también la banda correspondiente al dímero de HK853- CD ((HK853-CD)2).

En la Figura 55C se muestra que la reducción de la muestra 1 no fue del 100%, y mostró que HK853-CD estaba fosforilada así como un remanente de complejo entrecruzado HK853-CD:RR-D53A. La reducción de la muestra 2 mostró una débil fosforilación de HK853-CD. La reducción del control, correspondiente al dímero (HK853-CD)2 entrecruzado, mostró HK853-CD fosforilada así como un remanente no reducido del dímero entrecruzado.

Estos resultados indican claramente que HK853-CD se ha autofosforilado en el complejo entrecruzado HK853-CD:RR-D53A y por lo tanto este tipo de entrecruzamiento ha permitido cierta movilidad entre ambas moléculas necesaria para que se llevara a cabo la reacción de autofosforilación. Por otra parte, el

hecho de que en el complejo entrecruzado HK853-CD:RR468 no se observe fosforilación indica que estando las dos proteínas entrecruzadas no sólo es factible la autofosforilación, sino que además también es factible la fosfotransferencia y la defosforilación.

Figura 55. Ensayo de entrecruzamiento del complejo HK853-CD:RR468 con DTBP. En A se representa el gel SDS-PAGE sin β-mercaptoetanol correspondiente al entrecruzamiento con DTBP y en B el ensayo de fosforilación con [γ-32_{P]ATP de las}

muestras entrecruzadas (HK853-CD:RR468 silvestre (RRWT), HK853-CD:RR-D53A y

HK853-CD:RR-K105A) durante 1 y 30 min. En C se muestra el gel SDS-PAGE con β- mercaptoetanol autoradiografiado correspondiente a la banda cortada del dímero entrecruzado (1) HK853-CD:RR-D53A, del dímero (2) HK853-CD:RR-K105A, del dímero HK853-CD ((HK853-CD)2) (3). En rojo se enmarcan las bandas 1, 2 y 3 (gel B) y la

banda correspondiente al complejo entrecruzado (gel A).

Esta conclusión también se puede extraer a partir del resultado obtenido con el complejo entrecruzado HK853-CD:RR-K105A.

B SDS-PAGE + [γ-32P] ATP A SDS-PAGE 116.0 66.2 45.0 35.0 25.0 HK HK + DTBP HK+RR + DTBP 1’ 30’ 1’ 30’ 1’ 30’ K105A RRwt D53A ► ► HK853-CD~P ► HK853-CD:RR468~P (HK853-CD)2~P 1 1 ► ► HK853-CD~P ► HK853-CD:RR468~P (HK853-CD)2~P 45.0 35.0 25.0 14.4 + β-ME - β-ME 3 M C SDS-PAGE + [γ-32P] ATP 2 2 3 ► ► HK853-CD ► HK853-CD:RR468 (HK853-CD)2 M

En resumen, hemos sido capaces de observar fosforilación de HK853-CD en el complejo HK853-CD:RR468 entrecruzado con DMS o DTBP que contienen un brazo espaciador de 11,9 Å, confirmando la débil fosforilación del complejo HK853-CD:RR468 entrecruzado mediante puente disulfuro. Claramente, la autofosforilación de HK853-CD en el complejo entrecruzado está relacionada con la mobilidad necesaria para facilitar la conformación de autofosforilación estando RR468 unido. La presencia de un brazo espaciador, en comparación con los 2 Å del puente disulfuro nos informa de que incrementando esta distancia se pueden realizar los movimientos necesarios para adquirir las conformaciones de autofosforilación y fosfotransferencia debiendo ser ambas muy similares.