Fosforilación oxidativa

5.5.1 Introducción

La energía liberada por los procesos redox a lo largo de los complejos respiratorios se traduce en la síntesis de ATP a expensas de ADP y fosfato inorgánico, en el proceso que conocemos como fosforilación oxidativa. Recibe este nombre para distinguirla de procesos de fosforilación a nivel de substrato, del tipo hasta ahora visto en la glucolisis (fosfoglicerato kinasa y piruvato kinasa) y en una particular reacción del ciclo de Krebs (succinato tiokinasa).

En condiciones normales, ambos procesos (transporte electrónico y fosforilación oxidativa) se encuentran acoplados: es decir, a pesar de ser procesos independientes tienen lugar de forma simultánea. Sin embargo, hay ocasiones en las que los vamos a encontrar desacoplados, bien por la presencia de ciertos tóxicos (agentes desacoplantes) o bien en determinadas condiciones fisiológicas en los que la energía del transporte electrónico debe traducirse en la generación de calor sin producir energía libre química (en el tejido adiposo pardo en condiciones de hibernación, por ejemplo).

En un principio, tres eran las hipótesis que se presentaban para explicar el mecanismo de fosforilación oxidativa. Estas hipótesis consideraban que la formación de ATP era una especie de reversión de los procesos en los que participa este nucleótido.

(a) Uno de estos procesos es el suministro de energía libre química para reacciones termodinámicamente desfavorables. Así, la hipótesis del acoplamiento químico, postulaba que el transporte electrónico generaba compuestos de alta energía de hidrólisis (del tipo de fosfoenolpiruvato o 1,3 bisfosfoglicerato en la glucolisis) que transferían el fosfato de alta energía al ADP para formar ATP.

(b) Otro proceso que consume grandes cantidades de ATP es la contracción muscular (o el movimiento mecánico en general). Esto dio origen a la hipótesis del acoplamiento mecanoquímico, según la cual el transporte electrónico generaba en la mitocondria una configuración de alta energía potencial mecánica que al relajarse era capaz de mover la reacción de fosforilación de ADP para dar ATP.

(c) El ATP es asimismo consumido en grandes cantidades en los procesos de transporte activo (contra gradiente). Aquí está el origen de la hipótesis de acoplamiento quimiosmótico. En esta hipótesis, el transporte electrónico genera un gradiente de concentración en torno a la membrana interna mitocondrial que al destruirse liberaría la energía suficiente para llevar a cabo la síntesis de ATP. Gracias a los trabajos de Peter Mitchell hoy día se acepta universalmente esta hipótesis. El transporte electrónico genera un gradiente de protones de forma que se acidifica el espacio intermembrana (al tiempo, lógicamente, que el interior mitocondrial se alcaliniza). Cuando los protones vuelven al interior mitocondrial (a favor de gradiente) a través de un determinado complejo supramolecular presente en el membrana interna (el complejo FOF1, también conocido como complejo V) la energía liberada se aprovecha para la síntesis de ATP. En síntesis:

Transporte electrónico → bombeo de protones → fuerza protonmotriz → síntesis de ATP

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La denominación fuerza protonmotriz es análoga a la fuerza electromotriz que mueve a los electrones en un circuito eléctrico. Una visión esquemática del proceso de fosforilación oxidativa se presenta en la figura 5.24.

Ahora bien, en el mecanismo actualmente postulado para explicar la fosforilación oxidativa también tiene cabida parte de la hipótesis mecanoquímica: al circular los protones a favor de gradiente en el complejo FOF1, el ATP se forma gracias a la acción de un motor molecular presente en el mismo.

5.5.2 El complejo F

F

(ATP sintasa, EC 3.6.3.14)

Se trata de una estructura supramolecular integrada en la membrana interna mitocondrial, de tal manera que uno de sus componentes, FO (nótese que se trata de F “O mayúscula” y no de F

“cero”; la O procede de su sensibilidad a Oligomicina) está formando parte integral de la membrana mientras que el otro, F1, se proyecta hacia el interior de la mitocondria. Este complejo es visible al microscopio electrónico, y cuando se purifica F1 en condiciones controladas cataliza una reacción de hidrólisis de ATP:

ATP + H2O → ADP + Pi

Por lo que también es conocido como F1-ATPasa. Ahora bien, la reacción que realmente tiene lugar en este complejo es la inversa:

ADP + Pi → ATP + H2O De manera que hoy se prefiere la denominación de ATP sintasa.

El componente FO está incluido en la membrana interna. Está formado por subunidades a, b y c (de estas últimas entre 10 y 14 copias) formando un canal iónico a través del cual los

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protones volverán al interior mitocondrial a favor de un gradiente de concentración. El componente F1 tiene una estructura subunitaria α3β3γδε. Esta estructura se presenta en la figura 5.25, y en su conjunto constituye un motor molecular.

Las subunidades α y β, con tres copias cada una, forman una estructura cilíndrica que se proyecta hacia el interior de la mitocondria, la cual se une a FO mediante las subunidades c de éste con γ y ε. Este conjunto c10-γ-ε forma un rotor que gira en el interior de la membrana; las restantes subunidades, es decir: α3β3δab constituyen el estator del mismo (figura 5.26)

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El flujo de protones a favor de gradiente va a mover el rotor determinando cambios conformacionales en el estator que a su vez llevarán a cabo la síntesis de ATP a partir de ADP y Pi.

5.5.3 El proceso de síntesis de ATP

Podemos considerar que la porción α3β3 de F1 constituye un trímero de protómeros αβ. Cada uno de estos trímeros posee un sitio de fijación de nucleótidos. La conformación de estos sitios varía conforme rota la subunidad γ, que es parte del rotor (figura 5.26)

Los sitios de fijación en los protómeros αβ pueden estar en tres conformaciones distintas:

abierta, laxa y firme. En la configuración abierta el sitio puede fijar ADP + Pi o liberar ATP; en la conformación laxa el ADP + Pi fijado no puede desprenderse; en la conformación firme se favorece la condensación de ADP y Pi para formar ATP, el cual no puede desprenderse del sitio (figura 5.27).

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El proceso sería el siguiente para cualquiera de los tres sitios:

1. Un sitio abierto desprende el ATP formado y fija ADP + Pi.

2. La subunidad γ del rotor gira 120°, con lo cual el sitio cambia de abierto a laxo.

3. Un nuevo giro de γ hace que el sitio cambie de laxo a firme; tiene lugar la síntesis de ATP pero éste no se desprende.

4. Un nuevo giro de γ cambia el sitio de firme a abierto: el ATP se desprende y pueden acceder al sitio nuevamente ADP y Pi, con lo que el ciclo comienza otra vez.

Si tenemos en cuenta que el estator α3β3 es trimérico, veríamos los tres sitios funcionando según este ciclo, de manera que cuando un sitio está abierto, el siguiente está en conformación laxa y el siguiente en conformación firme. Así, una vuelta completa de la subunidad γ del rotor produce tres moléculas de ATP. Se ha estimado que este sistema puede rotar a velocidades de 130 revoluciones por segundo; esto supondría la síntesis de 390 moléculas de ATP por segundo y por complejo F0F1.

5.5.4 Procesos de transporte en la mitocondria

En la figura 5.24 veíamos que el proceso de fosforilación oxidativa tiene que estar necesariamente acompañado de dos procesos de transporte: entrada de ADP y Pi a la mitocondria y salida del ATP formado. Todas estas especies tienen carga eléctrica y no pueden atravesar libremente la membrana interna mitocondrial.

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Existen sistemas de transporte específicos para estos procesos. Uno de ellos es la Adenin nucleótido translocasa, un antiporte que intercambia ADP (citoplasma → mitocondria) por ATP (mitocondria → citoplasma). El gradiente protónico generado por el transporte electrónico favorece este antiporte, dado que el ATP aparece normalmente con cuatro cargas electronegativas (4-) mientras que el ADP tiene tres (3-). El exceso de carga electropositiva en el exterior mitocondrial favorece el transporte de la molécula más electronegativa (ATP).

Por su parte, el fosfato inorgánico H2PO4

(abreviadamente, Pi) ingresa en la mitocondria gracias a un simporte electroneutro acoplado a la entrada de un protón hacia la mitocondria, que está lógicamente favorecida por el gradiente creado por el transporte electrónico.

5.5.5 Desacoplamiento

Se estima que en condiciones de reposo aproximadamente un 20 % del oxígeno consumido en la cadena de transporte electrónico no se acopla a la fosforilación oxidativa debido a la pérdida de protones hacia el interior de la mitocondria.

Este desacoplamiento puede asimismo tener lugar mediante determinados tóxicos llamados generalmente desacoplantes. Quizá el mejor estudiado es el compuesto 2,4-dinitrofenol. Éste se comporta como un transportador hidrofóbico, interaccionando con las estructuras de la membrana interna y permitiendo que ésta se vuelva permeable a los protones. De esta manera se suprime el gradiente protónico y se impide la formación de ATP por fosforilación oxidativa. La energía liberada en condiciones de desacoplamiento se disipa en forma de calor.

En los mamíferos hibernantes y en los recién nacidos hay un tejido adiposo especializado, el tejido adiposo pardo, en el cual la fosforilación oxidativa y el transporte electrónico aparecen en gran parte desacoplados. De esta forma se favorece la generación de calor en estas condiciones. El desacoplamiento se debe a la presencia en las células adiposas pardas de una proteína, la termogenina, que se integra en la membrana interna mitocondrial y constituye un canal iónico para protones de manera que se anula el gradiente protónico y se impide de esa manera la fosforilación oxidativa.

5.5.6 Inhibidores de la función mitocondrial

En el descubrimiento de los distintos procesos que tienen lugar en la mitocondria los inhibidores han tenido un papel relevante. De la misma manera, estos inhibidores tienen muchos empleos prácticos (como antibióticos, defoliantes, herbicidas, fitosanitarios en general) aunque por lo general presentan una elevada toxicidad para la especie humana.

podemos citar los siguientes:

1. Inhibidores que actúan sobre el complejo I: Rotenona, Amital, Piericidina A 2. Inhibidores que actúan sobre el complejo III: Antimicina

3. Inhibidores que actúan sobre el complejo IV: Ion cianuro (CN^-), monóxido de carbono (CO).

Estos agentes actúan como ligandos de la sexta posición de coordinación de los grupos Hemo a y Hemo a3 presentes en este complejo. Esta posición en condiciones normales está vacante (a diferencia de otros citocromos, que la tienen ocupada). La ocupación por estos ligandos inhibe la función del complejo (citocromo oxidasa) y de ahí su elevada toxicidad.

4. Agentes que actúan sobre el componente FO de la ATP sintasa: Oligomicina 5. Agentes que actúan sobre el componente F1 de la ATP sintasa: Aurovertina

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6. Agentes desacoplantes: 2,4 Dinitrofenol (DNP); Diciclohexil carbodiimida (DCCI), Valinomicina. Este último es un antibiótico ionóforo, que se fija a la membrana y permite el paso de cationes como el K⁺ y el H⁺.

7. Inhibidores del intercambio ATP/ADP: Atractilósido.

5.5.7 Balance energético de la degradación aeróbica de piruvato y acetil-CoA

Consideraremos el ATP producido a través del transporte electrónico y la fosforilación oxidativa.

(a) Desde Acetil-CoA:

Isocitrato deshidrogenasa NADH 2.5 ATP

α-Cetoglutarato deshidrogenasa NADH 2.5 ATP

Succinato deshidrogenasa FADH2 1.5 ATP

Malato deshidrogenasa NADH 2.5 ATP

Succinato tiokinasa (substr.) 1 GTP