FRECUENCIA DE ANÁLISIS DE LAS REFERENCIAS.

Las respuestas espectrales obtenidas de una medida NIR-CI contienen información de la muestra así como del instrumento. Es por esta razón que es necesario corregir la respuesta del instrumento a través de la medición inicial del ‘fondo’ (background). Este procedimiento se lleva a cabo midiendo la intensidad de luz reflejada de un material altamente reflectante (referencia blanca) y la intensidad de un material altamente absorbente (referencia negra). Después de haber medido la luz reflejada por la muestra, la absorbancia NIR es calculada usando la relación entre la muestra y los materiales reflectante y absorbente según la siguiente ecuación [6]:

⎟

⎟

⎠

⎞

⎜

⎜

⎝

⎛

−

−

=

negro muestra negro blanco

R

R

R

R

R)

log

1

log(

Donde:

Rblanco= Intensidad de la radiación remitida por la referencia blanca.

Rnegro= Intensidad de la radiación remitida por la referencia negra.

Rmuestra = Intensidad de la radiación remitida por la muestra.

La respuesta del instrumento varía en el tiempo debido a cambios en las condiciones externas como luz o temperatura. Por esta razón es crucial repetir la adquisición de las referencias para corregir los valores de absorbancia de las muestras analizadas. La Figura 18 muestra el procedimiento de adquisición de las referencias y de una muestra de harina animal.

Figura 18. a: Muestras de harinas animales selladas. b: Apertura de la muestra para su análisis. c: Colocación de 1 g. de muestra en el espejo de acero inoxidable. d: Adquisición de referencia negra tapando el objetivo. e:

Adquisición de la referencia blanca con la cerámica blanca. f: Colocación de la muestra para su análisis.

En este estudio se evaluaron tres diferentes frecuencias de análisis (o momentos) de las referencias blancas y negras para determinar una metodología de análisis que permita que los parámetros basicos de la imagen (ej. intensidad) queden constantes a lo largo den analisis. Las frecuencias estudiadas fueron:

1. Cada muestra: las referencias negra y blanca fueron adquiridas antes de cada adquisición de imagen (en tiempo: cada diez minutos). Esta opción asegura una estabilidad muy alta aunque los tiempos de analisis, en el caso de un elevado número de muestras, pueden ser significativamente más largos que en el caso de frecuencias menores.

2. Cada cinco muestras (treinta minutos): las referencias negra y blanca fueron adquiridas cada cinco adquisiciones de imagen.

3. Cada diez muestras (aproximadamente una hora): las referencias negra y blanca fueron adquiridas cada diez adquisiciones de imagen.

Como muestra para analizar se utilizó una placa de Spectralon (Labsphere, Inc., North Sutton, NH), llamado de aquí en adelante material estándar o ME, un material blanco que tiene un nivel de reflectancia del 98-99% en el rango 250-2500 nm. Se realizaron las tres pruebas a través de diez analisis del material estándar por cada momento de análisis de referencia, como se explica a continuación:

Referencia cada muestra: R - ME - R - ME - R - ME - R - ME - R - ME - R - ME - R - ME - R - ME - R - ME - R - ME.

Referencia cada cinco muestras: R - ME - ME - ME - ME - ME - R - ME - ME - ME - ME - ME.

Referencia cada diez muestras: R - ME - ME - ME - ME - ME - ME - ME - ME - ME - ME.

Siendo R= referencias negra y blanca.

Las diez imágenes correspondientes a cada modalidad de frecuencia de referencia fueron reunidas en una usando la función de “concatenation” presente en el programa de tratamiento de imágenes ISYS (Marlvern Instruments, Maryland, U.S.A.). A continuación se realizó un “pixel binning” (agrupamiento de píxeles, Bin de ahora en adelante) [7] para disminuir el tamaño de datos y facilitar los futuros cálculos. Un Bin de 1 x 1 significa que el píxel individual se utiliza como tal. Un Bin de 2 x 2 significa que un área de 4 píxeles adyacentes se combina en un píxel más grande y así sucesivamente. La Figura 19 ilustra el efecto del Bin.

Figura 19. Representación de diferentes tratamientos de binning (1 x 1, 2 x 2, 3 x 3) y del efecto en la resolución de la imagen.

En este caso se creó un píxel correspondiente a la agrupación de 16 píxeles, es decir, se calculó el espectro medio de 16 píxeles adyacentes, aumentando de esta manera la relación S/R espectral disminuyendo la resolución espacial.

Con el fin de determinar la frecuencia óptima de analisis de la referencia se evaluaron tres diferentes estadísticos. El primero de ellos fue la STD calculada a la longitud de onda de 1520 nm para las diez muestras de cada una de las modalidades de frecuencia de referencia. La longitud de onda de 1520 nm fue seleccionada, ya que el detector del instrumento es calibrado por los fabricantes en este punto del espectro electromagnético. El material utilizado para la calibración del detector (Rare Earth Oxide Standard) es el que normalmente se usa para validar longitudes de onda en el rango 740-2000 nm por el Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST) [8], y tiene un pico característico en la longitud de onda indicada.

El segundo estadístico utilizado fue el error cuadrático medio (RMSE), cuya fórmula se indica en el Capítulo 1 de esta memoria. El cálculo del RMSE permitió obtener información sobre la variabilidad dentro de cada imagen concatenada teniendo en cuenta la contribución de las 51 longitudes de onda disponibles.

Finalmente se calculó la MD entre todos los píxeles correspondientes a cada análisis al centro de la población (espectro medio de la imagen), para medir la similitud entre imagenes.

La MD es definida por contornos elípticos que se extienden desde los centros de las clases o, en este caso, de las imágenes. Las fórmulas matemáticas y las aplicaciones de MD han sido descritas, entre otros, por Mark [9]. La distancia MD, de un punto X al centro de un grupo i, es descrita por la ecuación:

)

(

)'

(

2 i i

M

X

X

X

X

MD

=

−

−

Donde MD es la distancia, X es el vector multidimensional que describe la posición de punto x,

X

ies el vector multidimensional que describe la posición de la media del grupo ith,

(X

−X

i

)'

es la traspuesta del vector

(X

−

X

i

)

, y M es una matriz que determina

las medidas de distancia del espacio multidimensional estudiado.

La adquisición de las imágenes fue realizada en condiciones de oscuridad dejando encendida solamente la pantalla del ordenador.

In document Detección y cuantificación de la especie en harinas proteicas de origen animal mediante el uso de sensores hiperspectrales (página 132-136)