La falta de función de dRYBP en Drosophila no parece producir activación o represión de la apoptosis, ya que embriones dRYBP homozigóticos mutantes no presentan alteración en los patrones de expresión de caspasa 3 ni alteraciones en la tinción de Naranja de Acridina (datos no mostrados). Una leve y variable disminución de la apoptosis ha sido descrita en ratones deficientes de RYBP (Pirity y cols. 2005). Sin embargo, la falta de función de YAF2 en pez cebra, produce una fuerte inducción de la apoptosis mediada por la caspasa 8 (Stanton y cols. 2006).
La muerte celular apoptótica es necesaria durante el desarrollo y la vida de los organismos para la eliminación de células innecesarias, células infectadas o células dañadas. En los me-
canismos apoptóticos, las caspasas iniciadoras y efectoras juegan un papel central en la ma- quinaria de muerte celular por lo que es fundamental una precisa regulación de su expresión (Hay y Guo 2006). Señales extrínsecas, tales como ligandos (TNFs, Tumor Necrosis Factors) se asocian a TNFRs (Tumor Necrosis Factor Receptors), activan las caspasas iniciadoras, que a su vez activan las caspasas efectoras y desencadenan la apoptosis (Figura 59). También, la ac- tivación de los genes pro-apoptóticos (RHG) regulan la actividad de las caspasas impidiendo que las proteínas Inhibidoras de la apoptosis (DIAP) ejerzan su represión sobre las caspasas iniciadoras y efectoras (Hay y cols. 2004).
El procesamiento de las caspasas de su estado pro-caspasa inactiva a caspasa activa se realiza mediante proteolisis. La activación del procesamiento de las caspasas iniciadoras se lleva a cabo mediante la oligomerización, a través de interacciones proteicas mediadas por los dominios DED (Death effector domains) o CARD (caspase effector domain) que contienen las pro-caspasas. Este proceso, esta muy bien estudiado en humanos, sin embargo en Drosophila aún no se sabe si los homólogos a proteínas involucradas en este proceso, funcionan de la mis- ma forma. Así, por ejemplo (Figura 59), los TNRF en humanos (CD95/TNRFSF6/FAS) y los TNFs
D
iscusión80
Figura 59. ¿conecta dRYBP la vía apoptótica y la vía de respuesta inmune en Drosophila? Vía de la apoptosis extrínseca en mamíferos.
CD95R es uno de los receptores que inicia la vía extrínseca mediante la unión a su ligando CD95L. La caspasa iniciadora, pro-caspasa-8, uniéndose a FADD y formando el complejo DISC se activa y activa a la caspasa efectora, caspasa-3, induciendo la apoptosis. Respuesta inmune en Drosophila. La respuesta inmune se activa cuando componentes de la pared bacteriana son reconocidos por el receptor PGRP-LC. La activación del receptor inicia una cascada de señalización a través de IMD. FADD se une a la caspasa DREDD promoviendo la activación de ésta que, una vez activa libera a RELISH para su translocación al núcleo, lo que promueve la transcripción de genes que codifican péptidos bacterianos. Función hipotética de la proteína dRYBP. dRYBP produce la oligomerización entre FADD y DREDD en respuesta bien a señales extrínsecas apoptóticas, vía Eiger, o infección por bacterias Gram-negativas. Esto produce el procesamiento de DREDD que promueva la activación de las caspasas o de relish.
En el proceso apoptótico intervienen los genes pro-apoptótiocos Rpr, Hid y Grim (RHG), los cuales son inhibidos por la DIAPs, las cuales inhiben las caspa- sas.
contienen el DD (Death Domain), que puede reclutar la pro-caspasa 8 (que contiene un domi- nio DED- Death Efector Domain) a través de las proteína FADD (FAS-associated Death Domain and DED-containing protein) y se induce la formación del DISC (Death –inducing signalling complex) para producir la caspasa 8 activa en repuesta a la señal extrínseca (Siegel 2006).
Se ha descrito que la proteína RYBP/DEDAF interacciona con varias proteínas que contie- nen el dominio DED, como son FADD, pro-caspasa-8 (dFADD, DREDD respectivamente en
Drosophila), pro-caspasa 10 y DEDD (DED-containing DNA-binding protein) de estas dos últi-
mas no se ha descrito ningún homólogo en Drosophila por el momento. Además, también se ha observado, que altos niveles de RYBP/DEDAF en células de mamíferos aumenta la apopto- sis mediada por los TNFRs (Zheng y cols. 2001).
Nuestros resultados indican que altos niveles de dRYBP producen una fuerte activación de la apoptosis en el ala y en el halterio de Drosophila, y curiosamente en ninguno de los otros discos imaginales estudiados. La apoptosis mediada por dRYBP es dependiente de cas- pasas, ya que se inhibe con la sobre-expresión de p35 (Figuras 45 y 47), con altos niveles de DIAP (Figura 49), y disminuye en ausencia de una dosis de los genes RHG (Figura 50). Debido a las observadas interacciones de RYBP con las proteínas FADD y caspasa-8 (Zheng y cols. 2001), decidimos estudiar si la inducción de la apoptosis mediada por altos niveles de dRYBP era también dependiente de estos factores en Drosophila. Los resultados indican que en ausencia de dFADD y de DREDD (Figuras 51 y 52) no tiene lugar la apoptosis. Por ultimo, la apoptosis mediada por altos niveles de dRYBP no se produce a través de la vía JNK.
Los mecanismos por los que altos niveles de dRYBP produce apoptosis en el ala y en el halterio están siendo estudiados en el laboratorio. En el ala y en el halterio, altos niveles de dRYBP producen tanto apoptosis y des-represión de UBX en el ala y represión de UBX en el halterio. Se pensó que la inducción de apoptosis y el efecto en la expresión de UBX podrían estar relacionados. Sin embargo, discos imaginales donde la apoptosis se inhibe (Figuras 45,
47 y 49) mediante la sobre-expresión de p35 o de DIAP presenta des-represión de UBX en
el ala y represión de UBX en el halterio. De la misma forma, la sobre-expresión de la proteí- na mutante dRYBP-�ZF produce sobre-expresión de UBX, pero sin embargo la apoptosis no tiene lugar (Figura 55). Estas dos observaciones indican que la alteración de la expresión de UBX puede tener lugar en ausencia de la activación de la apoptosis.
La ausencia de apoptosis en mutaciones para dFADD y dredd, así como las observaciones de que DEDAF/RYBP promueve la oligomerización de esas proteínas (Zheng y cols. 2001) po- dría sugerir que cantidades elevadas de la proteína dRYBP induce la formación de los com- plejos dFADD/DREDD de forma que se produce más cantidad de caspasa-8 (DREDD) activa y la consecuente inducción de la apoptosis. Además, nuestros resultados también indican que la apoptosis es o bien dependiente del dominio N-terminal de dRYBP, o bien dependiente de la expresión de la proteína dRYBP en el núcleo, donde se ha encontrado interacción de RYBP con DEDD (DED-containing DNA-binding protein).
Discos de ala mutantes para dRYBP no parecen presentar patrones apoptóticos aberrran- tes. De la misma forma que discos de ala mutantes para dFADD (datos no mostrados) y discos mutantes para dredd (Georgel y cols. 2001, Naitza y cols. 2002). Estas observaciones podrían indicar que 1) Ninguno de estos factores interviene en las vías de apoptosis normal que tiene lugar durante el desarrollo, 2) Que existen otros factores redundantes que dan cuenta de la falta de fenotipos apoptóticos 3) Que es necesario eliminar los tres factores, dRYBP, dFADD y DREDD para impedir totalmente el procesamiento de la pro-caspasa 8, ya que estos tres factores interaccionan a través de los dominios DED para su procesamiento 4) Que el reque- rimiento de estos factores solo tenga lugar en respuesta a una determinado “contexto” ce- lular.
Se ha observado, que altos niveles de RYBP/DEDAF en células de mamíferos aumenta la apoptosis mediada por los TNFRs (Zheng y cols. 2001). Además, la sobre-expresión de RYBP
solo produce apoptosis en células tumorales (Danen-van Oorschot y cols. 2004, Noteborn 2005, Rohn y Noteborn 2004). Además se ha descrito que la proteína RYBP interacciona con la proteína Apoptina, la cual únicamente produce apoptosis en células tumorales (Danen- van Oorschot y cols. 2004). Por el momento no entendemos la razón por la cual dRYBP solo produce apoptosis en los discos de ala y de halterio, ya que todos los factores involucrados en las vías apoptóticas conocidas en Drosophila se expresan ubicuamente. El estudio detallado de este proceso nos ayudara a elucidar la existencia de un mecanismo extrínseco que solo se pone de manifiesto en determinados contextos celulares, de la misma forma que ocurre con la respuesta inmune donde también interviene estos tres factores (Figura 59).