Capítulo 4 Discusión 69
4.4 Funcionalizaciones de la superficie de la proteína 72
La arquitectura de la VP, como en otras peroxidasas, tiene el grupo prostético hemo conectado al solvente por dos canales principales y que son utilizados por los sustratos. Uno es de acceso a Mn2+ y
fenoles de bajo potencial redox; el otro es de acceso a H2O2 y cercano al W superficial que forma el
radical activo (Ruiz-‐Dueñas et al., 2008). En el caso de la modificación con W se añadieron 15 residuos a su superficie, según el incremento promedio en su peso molecular (Figura 41). Esta cuantificación no fue evidente en el caso de las modificaciones con H, Y, F. En el caso de W, la formación de al menos otro sitio catalítico por uno de estos nuevos residuos estuvo reflejada en el incremento de 51% de la oxidación de RRBB y de 89% en la eficiencia catalítica (kcat /KM ) para este sustrato (Tabla 20).
Para entender estos resultados hay que considerar que el ciclo catalítico de las peroxidasas empieza con una oxidación de dos electrones por el aceptor final, el H2O2, con lo que se promueve la formación del
compuesto I, que es el intermediario catalítico con mayor potencial redox. Una vez oxidado, un equivalente se convierte en FeIV= O y el segundo en un radical porfirina. Entonces, los electrones son
transferidos desde el sustrato en dos pasos (Wariishi et al., 1992). La oxidación del sustrato también procede mediante el mecanismo LRET, que implica la transferencia de electrones desde un radical superficial hasta el hemo durante la oxidación de grandes moléculas o de alto potencial redox (Ruiz-‐ Dueñas et al., 2009), esto especialmente en la VP. La presencia de un W expuesto al solvente y en proximidad al hemo es el sitio de oxidación de estos sustratos y es selectivamente oxidado por el compuesto I y compuesto II en el mecanismo LRET (Pogni et al., 2005; Ayala et al., 2001; Verdin et al., 2006, Tinoco et al. 2007; Ruiz-‐Dueñas et al., 2009). Este mecanismo permite que las peroxidasas degraden una amplia cantidad de sustratos, incluso en ausencia de mediadores catalíticos. Por esto la VP ha sido estudiada en la transformación de sustratos fenólicos y no fenólicos, como de hidrocarburos aromáticos policíclicos (Wang et al., 2003), colorantes industriales (Bratto et al., 2015), inhibidores endócrinos (Taboada-‐Puig et al., 2011) y pesticidas (Dávila-‐Vázquez et al., 2005).
En la VP de P. eryngii, sobre la cual se realizó el plegado de la secuencia de la VP en esta tesis, se han propuesto tres vías de LRET (Ruiz-‐Dueñas et al., 1999; Heinfling et al., 1998; Pérez-‐Boada et al., 2005). La fuente de electrones puede ser Trp164 o His232 (Trp170 o His82 para otra isoenzima de VP), expuestos y a menos de 11 Å del hemo. Por mutagénesis sitio dirigida demostró que el Trp164 es el que oxida el alcohol veratrílico y el Negro Remazol 5, y no los residuos His232 y His82. Resultados similares fueron obtenidos para LiP de P. chrysosporium (Doyle et al., 1998; Mester et al., 2001; Gelpke et al., 2002).
Los espectros de EPR (Figuras 45, 46 y 47) tienen sustento en aquellos reportados para la VP de P. eryngii (Trp164) (Pérez-‐Boada et al., 2005), de B. adusta (Trp 177) (Pogni et al., 2005) y de LiP (Trp171) (Blodig et al., 1999). Las muestras tuvieron diferente tiempo y patrón de formación de radicales al interactuar con H2O2. Todas las muestras fueron expuestas al peróxido y congeladas en menos de 6 segundos de
manipulación: a mayor señal de hierro después de la exposición a H2O2 (alrededor de los 100 mT), menor
fue la formación de radical al momento del congelamiento. En todos los espectros los electrones deslocalizados estuvieron presentes en 334-‐335 mT, a g∼2.00±0.0001, que fue identificado como radical proteico 171W en VP (Ayala et al., 2001; Pogni et al., 2005). La comparación específica del área encontrada para la formación de radicales, proveniente de la segunda integración de cada uno de los espectros, mostró diferencias (Figuras 45 b y 47). Primero, si se toma la señal del radical en la VP como 1 de formación, entonces F-‐VP, H-‐VP and Y-‐VP tuvieron 14, 8 y 4 veces más área de formación que en la VP. Los espectros de F-‐VP y H-‐VP fueron detectados en los 332 y 338 mY, respectivamente, formaron las típicas tres líneas de un espectro más puro de W (Ayala et al., 2001). Esto no fue detectado para VP, YVP o W-‐VP. Tercero, el valor de g fue distinto 2.0045 (0.0005). Los datos reportados (Tabla 20) demuestran que las modificaciones con W y Y son las principales promotoras de formación de radicales. En el caso de Y el incremento en 64% del TTN con RRBB fue evidente en su kcat y kcat / KM. La modificación con H no
mostró beneficios en la oxidación de RBB y la modificación con the F tuvo una eficiencia kcat / kM cercana
a la modificación con Y debido a la reducción de su KM pero no fue medible en su TTN.
Los espectros de F-‐VP, H-‐VP y Y-‐VP mostraron señales mucho más intensas y los patrones secundarios que sugieren otras interacciones estructurales de estos residuos u otras especies que no pudieron ser identificadas hasta este momento y que pudieran estar interactuando en F-‐VP y H-‐VP con el solvente o con el mismo radical W171 de manera no favorable en el TTN en la transformación de RRBB, pero un TTN mayor en la transformación de 2,6-‐DMP.
La drástica disminución en la actividad catalítica con manganeso puede ser atribuida a la modificación de los residuos Glu36, Glu40, Asp 175 que forman el sitio de unión a manganeso (Figura 44). Estos residuos están expuestos al solvente y susceptibles a ser químicamente modificados. Esto fue claramente confirmado con los diferentes ensayos que se realizaron para el ICP-‐OES. Es este mismo canal de acceso al hemo el utilizado por el 2,6-‐DMP (Ruiz-‐Dueñas et al., 2009), por lo que el incremento de la actividad catalítica de 47%, manteniendo la eficiencia con 2,6-‐DMP sugiere que no se necesitan iones de manganeso para su oxidación y que el canal de acceso al hemo está modificado, pero no bloqueado. La cantidad y naturaleza de los nuevos residuos superficiales tuvieron diferente efecto en la quelación de Mn2+, los grupos hidroxilo de Y pudieron haber establecido interacciones con el solvente acuoso de
forma favorable para el acceso de Mn2+, haciendo que tuviera la mayor k
cat y el menor valor de kM.
Mientras que W, H y F pudieran estar más orientados hacia dentro del canal a manera de “puertas cerradas”. Los valores de TTN de YVP y F-‐VP con 2,6-‐DMPpodrían sugerir diferente número de residuos añadidos y esto mejoraba o disminuía el acceso de este sustrato.
Finalmente, la actividad del W171 superficial de la VP de Pleurotus y Bjerkandera ha sido probada con experimentos de oxidación con N-‐bromosuccinimida (Pogni et al., 2005; Ayala et al., 2001). La inactivación de este residuo antes de las modificaciones podría generar evidencia para comprender mejor las interacciones de estos nuevos residuos añadidos.