5. DISCUSIÓN
5.1. GENERACIÓN DE LÍNEAS DE CTL ESPECÍFICAS DE LA PROTEÍNA F
Para llevar a cabo este trabajo se han generado con éxito diferentes líneas de CTL policlonales específicas de la proteína F de la cepa Long de VRS. Se han utilizado dos aproximaciones, generar líneas multiespecíficas empleando células infectadas con VRS como estimuladoras, o generar líneas monoespecíficas estimulando con péptido sintético. En el primer caso se utilizaron de forma novedosa las células BCH4 persistentemente infectadas con la cepa Long de VRS, siendo relativamente sencilla la puesta a punto de las condiciones de estimulación.
En la cepa A2 de VRS se habían descrito previamente dos epítopos presentados por Kd y reconocidos por CTL murinos, F85-93 (Chang y col. 2001) y F92-106 (Jiang y col. 2002), y en este trabajo se demuestra que F85-93 (KYKNAVTEL) se conserva como epítopo en la cepa Long, tal y como se espera por la secuencia conservada en el epítopo y sus regiones flanqueantes. Sin embargo, no tenemos ninguna evidencia de la presencia del epítopo F92- 106. A pesar de un 98% de identidad entre las proteínas F de las cepas A2 y Long de VRS (López y col. 1988), los residuos 11 y 12 del péptido F92-106 de 15 aa no se conservan (PT en A2 y AA en Long), y puede que sean críticos para la unión no canónica del epítopo a Kd. CTL generados a partir de ratones BALB/c inmunizados con el péptido F92-106 correspondiente a la cepa A2, son capaces de reconocer células BCH4 persistentemente infectadas con la cepa Long de VRS (Jiang y col. 2002), y sin embargo nuestros resultados indican que no se generan CTL F/F92-106 en ratones BALB/c infectados con el rVV vvF que codifica la proteína F de la cepa Long. Es posible que exista una reacción cruzada de CTL específicos del epítopo F92-106 de A2 con las células BCH4 que presentan el péptido de Long. Otra posibilidad es que exista una limitación en el repertorio de CTL con un TCR complementario al péptido de Long y no al de A2. No obstante, puesto que se trata de un péptido inusualmente largo y se desconoce su modo de unión a Kd, lo más probable es que el péptido F92-106 no sea un buen reactivo para mimetizar este epítopo potencial en la cepa Long.
Utilizando programas de predicción de epítopos y el virus vvF-∆F2 que codifica una forma mutante de la proteína F que carece de la subunidad F2, hemos identificado un epítopo de CTL que denominamos F249-258. Este epítopo es presentado por Kd como un nonámero (F249-257: TYMLTNSEL) o un decámero (F249-258: TYMLTNSELL), y está localizado cerca del sitio antigénico II para anticuerpos neutralizantes (López y col. 1998). Mediante reestimulación in vitro, hemos podido determinar la presencia de linfocitos T CD8+ específicos de F249-258 en ratones BALB/c infectados tanto con vvF como con el virus natural VRS. Se ha generado una línea CTL ∆F2/BCH4 que carece de clones específicos de
F85-93, en la que el nonámero F249-257 activó a la mitad de células CD8+ de la línea, mientras que el decámero F249-258 activó a casi todas las células CD8+ de la línea, sugiriendo que esta línea no reconoce otros epítopos. Sin embargo, en el caso de la línea CTL F/BCH4, que reconoce mayormente al epítopo F85-93, se observó la misma activación con el nonámero F249-257 y el decámero F249-258. Estas observaciones se explicarían si la mitad de los clones seleccionados en la línea CTL ∆F2/BCH4 tuviesen menor afinidad por el epítopo, por lo cual no reconocerían el nonámero. Los clones de mayor afinidad que reconocerían tanto el nonámero como el decámero, completarían la otra mitad de CTL presentes en la línea CTL ∆F2/BCH4, y serían los únicos existentes en menor número en la línea CTL F/BCH4. Estos resultados sugieren que el decámero F249-258 es probablemente un ligando natural de Kd, al menos en las células BCH4 utilizadas en la estimulación de líneas de CTL. No obstante, aunque son muchos los trabajos publicados en los que la identidad del péptido natural se infiere de péptidos sintéticos, la identificación correcta del péptido natural se debe realizar por extracción y purificación bioquímicas seguidas de espectrometría de masas, tanto en el caso de F249-258 como de F85-93. El péptido natural podría tener extensiones respecto al péptido sintético o estar modificado. De hecho un estudio reciente indica que si bien la mayoría de péptidos endógenos presentados por Kd son nonámeros, también existe un porcentaje considerable de péptidos más largos, con extensiones generalmente en el extremo carboxilo (Suri y col. 2006).
El epítopo F249-258 probablemente también existe en la proteína F de la cepa A2, ya que su secuencia y también la de las regiones flanqueantes, que pueden influenciar la eficiencia de presentación y procesamiento de antígeno (Del Val y col. 1991), se conservan en al menos 35 aa a cada lado. Sin embargo, el epítopo F249-258 no fue identificado en estudios previos (Chang y col. 2001; Jiang y col. 2002), cuya estrategia se basó en el empleo de péptidos solapantes que cubren la secuencia de la proteína F. El panel de péptidos de 15 aa solapantes en 5 aa utilizado en la identificación del epítopo no canónico F92-106 en la cepa A2, no incluía ningún péptido en el que el epítopo F249-258 estuviera completo (Jiang y col. 2002), lo cual explica que no se detectara. No obstante, tampoco se identificó el epítopo F85-93 a pesar de haber incluido el péptido QELDKYKNAVTELQLL con el epítopo completo, si bien se utilizaron linfocitos de pulmón de ratones infectados con VRS 7 días antes. No disponemos de la información de los péptidos empleados en el otro estudio (Chang y col. 2001).
Nuestros resultados demuestran que los programas de predicción de epítopos, aunque incapaces de predecir epítopos no canónicos, pueden ser herramientas poderosas en la identificación de epítopos de CTL, tal y como se ha discutido (Nussbaum y col. 2003). Decidimos sintetizar determinados péptidos correspondientes a epítopos putativos presentados por Kd en base a dos programas de predicción de epítopos basados en motivos
consenso de unión a MHC de clase I, y a un programa de predicción de extremos carboxilo probables en ligandos de MHC de clase I. Se ha demostrado que la predicción de epítopos de MHC de clase I basándose en motivos consenso no mejora cuando se combina también con programas de predicción de cortes carboxilo generados por el proteasoma, y sí cuando se considera la eficiencia de transporte por TAP como parámetro adicional (Peters y col. 2003). No empleamos este último algoritmo ya que su desarrollo fue posterior a la identificación del nuevo epítopo F249-258.
5.2. MÚLTIPLES VÍAS DE PROCESAMIENTO Y PRESENTACIÓN DE EPÍTOPOS DE LA