Los genes SKI

En 1978 se describió que mutaciones en ciertos genes, producían fenotipo superkiller en las cepas de S. cerevisiae, es decir, incrementaban la secreción de la toxina killer, y por lo tanto su fenotipo era más gresivo frente a las cepas sensibles. A estos genes se los denominó SKI (Superkiller) (Toh et al., 1978). Posteriormente se comprobó, que el número de copias de los virus killer (L-A), y del virus L-BC aumentaba en estos mutantes, indicando el efecto antiviral de esas mutaciones (Toh y Wickner, 1980; Widner y Wickner, 1993). Se ha comprobado que el motivo del efecto antiviral de las mutaciones en los genes SKI no depende de los virus ni del sistema killer, sino en que estos genes están involucrados en la degradación de los mensajeros del hospedador, por lo que un fallo en este sistema, induce la acumulación de RNAs en el citoplasma de S. cerevisiae (Johnson y Kolodner, 1995).

Los genes SKI se resumen en la tabla 3. Además, dedicaré unas líneas a comentar alguna de las características más importantes de los genes XRN1/SKI1 y SKI2, importantes en este trabajo.

Figura 11. Componentes del exosoma de S. cerevisiae. El complejo está formado por una estructura en forma de anillo y tres proteínas de ensamblaje que se anclan para mantenerlo. La actividad exonucleasa 3’5’ la lleva a cabo Rrp44p.

XRN1/SKI1

Este gen codifica la exonucleasa 5’3’ citoplasmática más importante en S. cerevisiae, Xrn1p. Esta proteína es necesaria para funciones a distintos niveles de los procesos celulares, como la degradación de mRNA y DNA de cadena sencilla, el correcto ensamblaje del retrotransposon Ty3 (Brown et al., 2000),ensamblaje de la tubulina en microtúbulos (Interthal et al., 1995), ciclo celular (Pathak et al., 2005) o cariogamia (Kim et al., 1990) entre otros. Debido a esta multifuncionalidad, el gen ha recibido otros nombres, como DST2, RAR5, SKI1, KEM1…

La enzima tiene 1528 aminoácidos y se localiza en los P-bodies, o cuerpos de procesamiento del RNA, en el citoplasma (Sheth y Parker, 2003). Aunque la deleción del gen no afecta a la viabilidad celular, sí produce ciertos efectos fenotípicos, como crecimiento lento, dificultad en la separación de los cromosomas en el cuerpo polar del huso (spindle body), muerte en ausencia de nitrógeno, deficiencias en recombinación durante la meiosis, y el diploide homozigótico no puede esporular. Es sintético letal con otros genes que participan en la degradación de RNAs, como SKI2 o SKI8 (Anderson y Parker, 1998).

Esta exonucleasa tiene especial predilección por sustratos sin poliadenilar ni cap, por lo que es probable que los genomas de virus RNA de S. cerevisiae como 20S RNA y 23S RNA puedan ser dianas de esta proteína (Hsu y Stevens, 1993; Johnson y Kolodner, 1995).

Gen Función Referencias

SKI1 (XRN1) Exonucleasa 5’3’ implicada en multitud de

procesos biológicos. (Johnson y Kolodner, 1995) (Stevens, 2001)

SKI2 Helicasa de RNA implicada en la degradación de

mRNA 3’5’. Forma parte del complejo SKI con Ski3p y Ski8.

(Anderson y Parker, 1998) (Brown et al., 2000)

SKI3 (SKI5) Regula el exosoma. Forma el Complejo SKI con

Ski2p y Ski8py además inhibe la presecia de formas no poliadeniladas.

(Brown et al., 2000)

SKI4 (CSL4) Proteína de ensamblaje del núcleo del exosoma.

Esencial. (van Hoof et al., 2000)

SKI6 (RRP41) Subunidad del anillo del exosoma. Esencial. (Benard et al., 1998)

SKI7 Proteína adaptadora entre el exosoma y el

complejo SKI. (van Hoof et al., 2000) (Araki et al., 2001) (Wang et al., 2005)

SKI8 (REC103) Forma parte del complejo SKI con Ski2p y Ski3p.

Además está implicada en la rotura de doble cadena durante la meiosis.

(Gardiner et al., 1997) (Brown et al., 2000) (Arora et al., 2004) (Brown et al., 2000)

SKI2

El gen SKI2 codifica una helicasa de RNA de 146 kDa que utiliza la hidrólisis del ATP para producir cambios conformacionales en la estructura del RNA o en las interacciones RNA proteína (de la Cruz et al., 1999). Se encuentra formando parte de un heterotetrámero junto con una molécula de Ski3p y dos de Ski8p (Synowsky y Heck, 2008). Este complejo citoplasmático es esencial para la correcta actividad del exosoma (Anderson y Parker, 1998; Brown et al., 2000).

La deleción de este gen no produce efecto fenotípico evidente sobre su hospedador, aunque sí se observa un incremento del RNA citoplasmático que carece de grupos cap y sin poli(A) (Anderson y Parker, 1998).

Dado el efecto antiviral demostrado en el virus L-A (Widner y Wickner, 1993), y al participar en la degradación de mensajeros citoplasmáticos, el número de copias del virus 20S RNA podría estar también regulado por Ski2p.

“Probamos a través de la lógica, pero descubrimos con la intuición”

ARISTÓTELES

O

OBBJJEETTIIVVOOSS

Al comienzo de este trabajo se acababa de poner a punto en el laboratorio el sistema de generación de 20S RNA a partir de la expresión de su cDNA clonado en un plásmido. Esto nos permitía realizar experimentos de genética reversa para conocer in vivo las señales en cis necesarias en su replicación. Asimismo, se podía abordar el estudio de factores del hospedador implicados en su mantenimiento.

Por consiguiente, los objetivos planteados en este trabajo son los siguientes:

1. Estudio de las señales en cis que afectan a la replicación y formación de complejos p91/20S RNA.

2. Efecto de los sistemas de degradación de mRNAs de S. cerevisiae en la generación y mantenimiento de 20S RNA.

3. Identificar posibles factores del hospedador formando parte de los complejos

“En principio la investigación necesita más cabezas que medios”

SEVERO OCHOA

1. MICROORGANISMOS UTILIZADOS

Este trabajo se ha realizado con la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae. Este microorganismo fue descrito por E. C. Hansen en 1838, aunque en 1680 ya se sabía que estaba presente en la cerveza. Pertenece al Phylum Ascomycota, Clase Saccharomycetes, Orden Saccharomycetales, Familia Saccharomycetaceae. La palabra Saccharomyces precede del griego y significa “hongo de azúcar”, mientras que cerevisiae proviene del latín y significa “de cerveza”.

En este trabajo se utilizaron diferentes estirpes de S. cerevisiae con distintas combinaciones de virus RNA. También se emplearon varias cepas de Escherichia coli para la amplificación y expresión de plásmidos. Todas ellas, así como su procedencia y características genéticas se recogen en la TABLA 4. Las cepas de S. cerevisiae se conservaron en YPAD 50% - glicerol 50% a -80ºC, y las cepas de E. coli se conservaron en glicerol al 30% a -80ºC.

TABLA 4: Estirpes empleadas en este trabajo

Nombre Características Origen

Saccharomyces cerevisiae

2928 a ura3 his3∆1 trp1 20S RNA, 23S RNA-o, L-A -o, L-BC Esteban (2003) 2928-4 a ura3 his3∆1 trp1. 20S RNA-o, 23S RNA-o, L-A -o, L-BC Esteban (2005) 2928-5 a ura3 his3∆1 trp1 20S RNA-o, 23S RNA, L-A -o, L-BC Esteban (2003) 1101 α kar1-1 his4 (KIL-K1). 20S RNA, 23S RNA-o, L-A, L-BC Wickner, R. B.‡ BY4741 a his3∆1 leu2∆0 met15∆0 ura3∆0. 20S RNA-o, 23S RNA-o, L-A, L-BC Revuelta, J. L 

XRN1∆ a his3∆1 leu2∆0 met15∆0 ura3∆0 XRN1∆::kanMX4. 20S RNA-o, 23S

RNA-o, L-A, L-BC

Revuelta, J. L 882 a his3∆1 leu2∆0 met15∆0 ura3∆0, XRN1::KanMX4.Citoducido XRN1∆

con 20S RNA. 20S RNA, 23S RNA-o, L-A, L-BC

Este trabajo

SKI2∆ BY4741 con SKI2∆::KanMX4. Revuelta, J. L.

SKI3∆ BY4741 con SKI3∆::KanMX4. Revuelta, J. L.

SKI8∆ BY4741 con SKI8∆::KanMX4. Revuelta, J. L.

896 BY4741 con SKI2∆::KanMX4. 20S RNA¥ _{Este trabajo}

897 BY4741 con SKI3∆::KanMX4. 20S RNA¥ _{Este trabajo}

898 BY4741con SKI8∆::KanMX4. 20S RNA¥ _{Este trabajo}

923 BY4741 SKI7∆::KanMX4. 20S RNA¥ Este trabajo

913 BY4741 con SKI2∆::KanMX4. L-A-o _{Este trabajo}

924 BY4741 con SKI2∆::KanMX4. 20S RNA+ L-A-o _{Este trabajo}

HSP26∆ BY4741 con HSP26∆::KanMX4. Revuelta, J. L.

Escherichia coli

DH5α F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80∆lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK- mK+), λ–

(Meselson y Yuan, 1968) CJ236 F’, dut1, ung1, thi-1, relA1/pCJ105(F' camr) (Joyce y Grindley, 1984) BL21 (DE3) F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3) pLysS(cmR) (Studier y Moffatt, 1986) ‡ _{Dr. R. B. Wickner, Nacional Institutes of Health, Bethesda, MD (USA).}

 _{Dr. J. L. Revuelta. Departamento de Microbiología y Genética. Universidad de Salamanca.}

Functional Analysis of Yeast Genes Discovered by Systematic DNA Sequencing:

(EUROFAN 1). CE. BIO4-CT95-0080/CICYT BIO96-1760-C04-04-CE. 1996-1998. (EUROFAN 2). CE. BIO4-CT97-2294/CICYT BIO98-1515-CE. 1997-2000.

¥ _{El virus 20S RNA fue generado en estas cepas a partir de un vector de expresión.}

 _{Estas cepas fueron creadas mediante la eliminación del virus L-A por crecimiento a alta temperatura.}