Pardini, L.; 3Carral, L.A.; 1Bernstein, M.; 1Gos, M.L.; 3Olejnik, P.; 1Unzaga, J.M.; 3Kaufer, F.J.;
3
Durlach, R.A.; 1Venturini, M.C.
1
Laboratorio de Inmunoparasitología, FCV, UNLP. 2CONICET, Argentina.
3
Centro de Toxoplasmosis y otras Zoonosis, Hospital Alemán, Buenos Aires
T. gondii puede producir en humanos morbilidad y mortalidad en el feto si la infección se produce
durante el embarazo. Se han realizado numerosos aislamientos de T. gondii de animales en Argentina, pero no a partir de casos humanos. El objetivo de este estudio fue analizar la placenta de una mujer seropositiva a T. gondii con el propósito de realizar el aislamiento del parásito y caracterizarlo molecularmente. La serología previa (36 semanas) en el Hospital Alemán fue Sabin- Feldman 1:16000, inmunofluorescencia indirecta IFI-IgG 1:4000, IFI-IgM 1:160, ISAGA-M 1:1000, IgA 1:1000, IgE negativa y la prueba de avidez baja 6%, la placenta se obtuvo en el parto (37 semanas), se procesó y se inocularon dos ratones MNRI. Al mes se sacrificaron y se realizó la reacción de Sabin-Feldman, positiva 1:16000 y se observaron quistes en cerebro. La suspensión de cerebro se inoculó en dos ratones. Uno murió a las 3 semanas y el otro se sacrificó al mes, se obtuvo suero, cerebro, corazón, diafragma y pulmón y las muestras se enviaron al laboratorio de Inmunoparasitología donde se procesó el cerebro y se inocularon 4 ratones Swiss. Para la prueba de PCR se extrajo ADN del cerebro y se utilizaron los primers específicos TOX5-TOX8. Se amplificó ADN por nested-PCR para los marcadores nSAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c29-2, c22-8, L358, PK1 y APICO seguido por cortes con enzimas de restricción (RFLP). La serología por IFI del segundo ratón inoculado fue 1:6400 y la de los 4 ratones de 1:3200 (2) y 1:6400 (2). Se identificaron en fresco quistes morfológicamente compatibles con los de T. gondii. La prueba de PCR fue positiva, y se concluyó que el presente aislamiento es Tipo II para los nueve marcadores. Dado que el Tipo II es poco frecuente en Sudamérica es importante destacar que a nivel mundial es uno de los genotipos más frecuentes en infecciones congénitas y pacientes inmunosuprimidos. De acuerdo a nuestro conocimiento este es el primer aislamiento y caracterización molecular de T.
gondii a partir de material procedente de humanos en Argentina.
Palabras claves: toxoplasmosis, humana, genotipificación. Modalidad de exposición: POSTER
151
4-EXPRESIÓN DE CITOQUINAS EN JERBOS INFECTADOS CON GIARDIA
LAMBLIA
Serradell, M.C.; Gargantini, P.R.; Saura, A.; Luján, H.D.
Laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Medicina. Universidad Católica de Córdoba, Argentina. e-mail: [email protected]
La giardiasis es una de las enfermedades intestinales humanas más comunes en el mundo cuya gravedad depende de múltiples factores, tanto del parásito como del hospedador. Giardia lamblia tiene un ciclo de vida simple con formas quísticas infecciosas y trofozoítos vegetativos. Varios modelos experimentales se han utilizado para evaluar el perfil clínico-patológico, siendo los jerbos (Meriones unguiculatus) un modelo altamente adecuado (alta susceptibilidad a la infección, eliminación abundante de quistes y alteraciones fisiopatológicas similares a las observadas en humanos). No obstante, estos animales no son ampliamente usados debido a la carencia de herramientas esenciales para estudios inmunológicos. Debido a la ausencia de datos disponibles sobre el perfil de citoquinas (CKs) en la infección, evaluamos por RT-PCR en tiempo real los niveles de mRNA de CKs representativas de varios perfiles inmunes (IL-4, IL-5, IFN-, IL-1β, IL- 6, TNF-, IL-17, IL-10 y TGF-β) en Placas de Peyer (PP), ganglios linfáticos mesentéricos (MLN) y bazo, a las 2 y 4 semanas pos-infección (spi). El curso de la infección se evaluó cuantificando quistes en heces mediante inmunofluorescencia, mostrando pico entre las 2 y 3 spi y comienzo de resolución a las 4 spi. Los animales infectados desarrollaron respuesta inmune (RI) humoral local (incremento de sIgA intestinal) y sistémica (aumento sérico de IgG e IgA). Los perfiles de CKs fueron diferentes durante el curso de la infección, mientras que a las 2 spi hubo incremento de CKs pro-inflamatorias, conjuntamente con algunas Th2 y Treg; a las 4 spi se observó aumento de IL-5 en todos los órganos, acompañado con aumento de IL-4 y disminución de IFN- en PP y aumento de TGF-β en MLN. Estos resultados sugieren que en el pico de la infección habría una RI inflamatoria colaborando con el control de la misma, pero que sería regulada hacia un perfil Th2 en la etapa de resolución.
Palabras claves: G. lamblia, jerbos, citoquinas Modalidad de exposición: POSTER
152
5- PUESTA A PUNTO DE UNA TÉCNICA DE IDENTIFICACIÓN DE ADN DE
PLASMODIUM POR PCR A PARTIR DE MUESTRAS DE SANGRE EN PAPEL
DE FILTRO
Silva J.L.; Lucero R. H., Formichelli L.; Ramirez P.G.; Stein M.
Área de Biología Molecular y Área de Entomología, Instituto de Medicina Regional, Universidad Nacional del Nordeste, Resistencia, Chaco e-mail: [email protected]
Dada la necesidad de diagnosticar rápidamente la malaria para un óptimo tratamiento, resulta conveniente realizar una técnica que ofrezca una alternativa práctica a las utilizadas hoy día en nuestro país, como la aplicación de PCR. Se puso a punto una técnica de identificación de ADN de
Plasmodium mediante PCR a partir de muestras de sangre en papel de filtro. Se desarrolló una
técnica de extracción de ADN original que consistió en cortar secciones circulares de los papeles de filtro, colocarlos en tubos Eppendorf y añadir 700 l de solución de homogeneización con CTAB al 2%, se incubó por una hora a 56ºC, se añadieron 700 l de cloroformo-alcohol isoamílico y centrifugó tres veces a 5000 rpm/5 minutos recuperando el sobrenadante; se agregaron 700 l de alcohol isopropílico centrifugando a 13000 rpm/ 15 minutos descartando el sobrenadante, se lavó el pellet con un volumen de etanol 70%, centrifugando a 13000 rpm/ 5 minutos, se secó y resuspendió el ADN con l de agua destilada estéril. Se colocó 10 l de cada muestra de ADN con una solución madre con agua destilada estéril, buffer1X, MgCl2 1,5 mmol/l, dNTPs 0,5 mol/l, 0,5
mol/l de cada primer UNR y PLF (amplifican una secuencia del gen de la subunidad pequeña ribosomal 18S de Plasmodium), 0,075 U/l de DNA polimerasa Taq. Se programaron en un termociclador los ciclos: 5 minutos a 94ºC, 40 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 60ºC, y 90 segundos a 72ºC. Por electroforesis en gel de agarosa al 2% y tinción con bromuro de etidio se visualizaron bandas de 700 a 800 pb correspondientes al ADN de Plasmodium spp. Estos resultados aún no han sido comparados con otras técnicas.
Palabras claves: malaria, PCR, Plasmodium. Modalidad de exposición: POSTER
153
6- ANGIOSTRONGYLOSIS ABDOMINAL: DESARROLLO DE DOS PRUEBAS
INMUNODIAGNÓSTICAS EMPLEANDO COMO ANTÍGENO HUEVOS DEL
PARÁSITO
Abrahams- Sandí E. (1); Mesén-Ramírez P. (2)
(1) Universidad de Costa Rica, Departamento de Parasitología, San José, Costa Rica.
[email protected] (2)Centro Nacional de Referencia en Parasitología, Instituto
Costarricense de Investigación y Enseñanza en Nutrición y Salud, San José, Costa Rica
Angiostrongylus costaricensis es el nematodo responsable de la angiostrongiliosis abdominal, una
zoonosis exclusiva del continente americano. La infección con el parásito puede llevar al desarrollo de un fuerte proceso inflamatorio de tipo granulomatoso, acompañado en algunos casos de obstrucción del lumen intestinal, peritonitis, ulceras y hemorragias. La prueba diagnóstica confirmatoria es el hallazgo del gusano adulto en muestras histológicas de pacientes sometidos a resecciones quirúrgicas, y a más de cuatro décadas de la descripción del primer caso de esta enfermedad, el diagnostico en el laboratorio clínico sigue siendo uno de los principales desafíos. Nuestros estudios preliminares sobre la cinética de la respuesta humoral hacia diferentes estadios evolutivos del parásito permitieron identificar antígenos candidatos para el diseño de una prueba serológica que sirviera de complemento a la clínica. Huevos del parásito obtenidos de hembras adultas de A. costaricensis fueron empleados para el desarrollo de una técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI) y una prueba inmunoenzimática (ELISA) que detectan IgG e IgG1 en el suero de pacientes sospechosos. Para la obtención del antígeno se incubaron hembras del parásito en medio RPMI suplementado con antibióticos, a 37ºC durante 3 días. Los huevos expulsados por las hembras al medio fueron recolectados diariamente, lavados con PBS estéril y almacenados a -20 ºC hasta su utilización. Para la IFI se emplearon huevos completos y en el caso del ELISA se empleó un extracto crudo de las formas, obtenido por destrucción con sonicador. La IFI diseñada detecta IgG total en suero, con un título de corte de 1/16 y una sensibilidad del 94%, y una especificidad del 85%. EL ELISA, diseñado para la detección de IgG1 en suero, presenta un punto de corte de 0,24 DO, con una sensibilidad y especificidad del 87% y 90,5% respectivamente. Sólo se obtuvo reacción cruzada al emplear suero de pacientes con infección por Strongyloides
stercoralis.
Palabras clave: Angiostrongiliosis abdominal, inmunodiagnóstico, huevos Modalidad de exposición: POSTER