Grupos experimentales

2.3.1 Objetivo 1: Estudiar si el PC isquémico, al modular los mecanismos implicados en la

mayor vulnerabilidad de los hígados grasos a la lesión de I/R, protege frente a la lesión hepática y pulmonar asociada al trasplante de hígados grasos. Evaluación de la implicación del NO en los efectos del PC isquémico sobre cada uno de estos mecanismos. Para ello se establecieron los siguientes protocolos experimentales:

Protocolo 1. Estudiar si el PC isquémico, al modular los mecanismos implicados en la mayor vulnerabilidad de los hígados grasos a la lesión de I/R, protege frente a la lesión hepática y pulmonar asociada al trasplante de hígados grasos (Figura 30).

Para el desarrollo de este protocolo se realizaron los siguientes grupos experimentales:

1. Sham (n=12, 6 Ob y 6 Ln): Animales Ln y Ob fueron sometidos a anestesia, laparotomía transversal y se ligaron las venas suprarrenal derecha, la arteria hepática y la vena diafragmática. Después se procedió a la recogida de las muestras y se sacrificaron los animales.

2. Trasplante (TX) (n=24; 12 trasplantes, en 6 de los cuales se utilizaron Ob como donantes y en los otros 6 se utilizaron Ln como donantes): El animal donante fue sometido al protocolo quirúrgico correspondiente y tras la perfusión del hígado con la solución de preservación de la UW a 4ºC, el hígado se mantuvo durante 6 h a 4ºC en la misma solución de preservación. Transcurridas éstas, se realizó el trasplante de hígado utilizando siempre como receptor ratas Zucker Ln de acuerdo con la técnica de Kamada

descrita anteriormente. Transcurridas 4 h desde el inicio de la reperfusión del órgano se procedió a la recogida de las muestras.

3. Precondicionamiento isquémico + Trasplante (PC+TX) (n=24; 12 trasplantes, en 6 de los cuales se utilizaron Ob como donantes y en los otros 6 se utilizaron Ln como donantes): Se realizó del mismo modo que el grupo 2, pero previamente a la perfusión del hígado con la solución de preservación se realizó el PC isquémico que consistió en 5 min de isquemia y 10 min de reperfusión (Serafín y cols. 2002).

La duración de los períodos de isquemia fría y de reperfusión aplicados para la realización de esta tesis están basados en estudios anteriores en los que observó que la preservación fría durante 6 h induce lesión hepática en hígados posteriormente trasplantados, y que tras 4 h de reperfusión los parámetros de lesión hepática alcanzan los máximos niveles (Camargo y cols. 1997; Serafín y cols. 2002; Sun Z. y cols. 2003).

Tras 4 h de reperfusión se recogieron muestras de sangre, hígado y pulmón. Para evaluar la lesión hepática asociada al trasplante de hígados grasos se realizaron las siguientes determinaciones: actividad plasmática de transaminasas, lesión por necrosis mediante estudio histológico del tejido hepático y lesión por apoptosis mediante determinación de los niveles hepáticos de caspasa-3 y tinción TUNEL en cortes histológicos de hígado. La lesión pulmonar se evaluó mediante la determinación de los niveles de malonildialdehído (MDA) y de la actividad de la MPO en pulmón; y se realizó el estudio histológico del tejido pulmonar. Para evaluar el efecto del PC isquémico sobre las alteraciones microcirculatorias se estimó el flujo sanguíneo hepático y el flujo portal durante la reperfusión. Se determinó la actividad de la MPO en el tejido hepático para evaluar el efecto del PC isquémico sobre la infiltración de neutrófilos; y los niveles plasmáticos de TNF-Į para evaluar su efecto sobre la activación de células de Kupffer. Para el estudio del efecto del PC isquémico sobre el estrés oxidativo asociado al trasplante de hígados grasos se midieron los niveles de MDA, y se evaluaron los sistemas antioxidantes GSH y SOD en el tejido hepático. Además se evaluó el papel del sistema generador de RLO xantina/XOD en los hígados esteatósicos durante la preservación fría y el efecto del PC isquémico sobre el mismo, para lo que fue necesario añadir los siguientes grupos experimentales:

4. Control (n=12, 6 Ob y 6 Ln): Los hígados de animales Zucker Ln y Ob fueron perfundidos con solución de preservación de la UW a 4ºC. Después se procedió a la recogida de las muestras hepáticas y se sacrificaron los animales.

5. Isquemia (I) (n=12, 6 Ob y 6 Ln): Los hígados de animales Zucker Ln y Ob fueron perfundidos con solución de preservación de la UW a 4ºC, y preservados a 4ºC en la misma solución de preservación durante 6 h. Transcurridas éstas se procedió a la recogida de las muestras hepáticas.

6. Precondicionamiento isquémico + Isquemia (PC+I) (n=12, 6 Ob y 6 Ln): Se realizó del mismo modo que el grupo 5, pero antes de la perfusión del hígado se realizó el PC isquémico (Serafín y cols. 2002).

Al final del periodo de isquemia se recogieron muestras de tejido hepático para la determinación de los niveles de xantina y de la actividad de XDH/XOD.

Para el estudio del papel del sistema xantina/XOD en el daño hepático y pulmonar tras el trasplante de hígados esteatósicos, además se añadió el siguiente grupo experimental:

7. Trasplante + Alopurinol (TX+allop) (n=24; 12 trasplantes, en 6 de los cuales se utilizaron Ob como donantes y en los otros 6 se utilizaron Ln como donantes): Se realizó del mismo modo que el grupo 2, pero justo antes de iniciarse la reperfusión del hígado en el receptor se administró un inhibidor de la XDH/XOD, el alopurinol (100 mg/kg, bolus iv.). El alopurinol es un análogo de la hipoxantina que es convertido a oxipurinol por la XDH/XOD inhibiendo de ese modo la formación de RLO a partir de la hipoxantina/xantina. Se administró al iniciarse la reperfusión para excluir los posibles efectos beneficiosos del alopurinol durante la isquemia (Fernández y cols. 2002; Jaeschke 2002a)

Tras 4 h de reperfusión se recogieron muestras de sangre, hígado y pulmón. Se evaluó la lesión hepática por determinación de la actividad plasmática de las transaminasas y mediante estudio histológico del tejido hepático. Para evaluar la lesión pulmonar se determinaron los niveles de MDA y la actividad de la MPO en el pulmón y se llevó a cabo el estudio histológico del tejido pulmonar. Además las muestras de hígado fueron procesadas para la determinación de los niveles de MDA.

Protocolo 2. Evaluación de la implicación del NO en los efectos del PC isquémico sobre los mecanismos responsables de la mayor vulnerabilidad de los hígados grasos a lesión de I/R

(Figura 30).

Para desarrollar este protocolo se añadieron los siguientes grupos experimentales:

8. Precondicionamiento isquémico + isquemia + L-NAME (PC+I+NAME) (n=12): Se realizó del mismo modo que el grupo 6, pero 5 min antes de realizar el PC isquémico se administró L-NAME (10 mg/kg, i.v.), que es un análogo de la L-arginina que inhibe de forma inespecífica la síntesis de NO (Serafín y cols. 2002).

9. Precondicionamiento isquémico + Trasplante + L-NAME (PC+TX+NAME) (n=24; 12 trasplantes, en 6 de los cuales se utilizaron Ob como donantes y en los otros 6 se

utilizaron Ln como donantes): Se realizó del mismo modo que el grupo 3, pero 5 min antes de realizar el PC isquémico se administró L-NAME (10 mg/kg, i.v.).

En el caso del grupo 8, tras la preservación fría de 6 h, se recogieron muestras hepáticas para la determinación de la acumulación de xantina y de la actividad XDH/XOD. En el caso del grupo 9, tras 4 h de reperfusión se recogieron muestras de sangre, hígado y pulmón y se realizaron las mismas determinaciones que en los grupos 1, 2 y 3.

GRUPOS EXPERIMENTALES DETERMINACIONES