Grupos de microorganismos presentes en el queso blanco fresco

La evaluación microbiológica de seis tipos de queso blanco fresco, en los dos períodos de tiempo tuvo como objetivo el aislamiento de un considerable número de cepas bacterianas que pudieran ser productoras de AB, además de conocer el orden de magnitud en que cada grupo de bacterias estaba presente. Se trabajó con diluciones bajas, por lo cual se obtuvieron recuentos elevados que representan el valor estimado de las ufc/g (Apéndice A.I). Se evaluó el recuento de Pseudomonas sp., Staphylococcus sp., Enterococcus sp., BAL y coliformes con miras a aislar diversas especies comúnmente asociadas con la producción de aminas biógenas como la histamina, tiramina y putrescina (Chen et al., 1989; González et al., 1998; Martuscelli et al., 2005; Landete et al., 2007a; De las Rivas et al., 2008).

En la Figura 4.1 y en el Apéndice A.I se observan los resultados del recuento de los grupos de microorganismos evaluados, de estos se puede destacar que el género Pseudomonas presentó los menores recuentos en la mayoría de los quesos analizados. En el primer periodo evaluado los recuentos más bajos se observaron en el queso guayamano (1,4x104 ufc/g) y los más altos en queso cuajada (1,7x105 ufc/g), mientras que en el 2009, los menores recuentos de Pseudomonas sp. fueron los de queso de búfala (1,3x104 ufc/g) y los más altos los de queso guayamano (6,0x104 ufc/g). El queso de cabra fue el que presentó la mayor diferencia en el número de coliformes entre los dos periodos de tiempo (Figura 4.2 b), registrando recuentos de 4,4x107 y 3,2x106 en los periodo 2008 y 2009 respectivamente. En los quesos restantes el número de ufc/g de coliformes osciló en el orden de 1,5x106 y 6,6x106. Autores como Maldonado y Llanca (2008) reportaron valores promedios para coliformes totales en queso “de mano” de 2,2x106 NMP/g, los cuales superaron el valor máximo recomendado por la norma COVENIN 3821:2003 (2,1x104 NMP/g), mientras que Díaz y González (2001), hallaron

a b

contenidos de coliformes totales superiores a 1,0x104 NMP/g en muestras de queso blanco fresco semi-duro. Araya et al. (2008) encontró valores comprendidos entre < 10 ufc/g y 1,3x106 ufc/g para coliformes totales en muestras de queso de cabra elaborados con leche pasteurizada.

El recuento de Enterococcus sp. para los seis tipos de queso en los dos periodos de tiempo (Figura 4.1 a y b) osciló entre 1,5x104 ufc/g y 2,5x106 ufc/g, los cuales son inferiores a los reportados por Ferrer et al. (1987), en queso tipo palmita elaborado con leche cruda en el que se alcanzaron valores de 1,0x107 ufc/g.

Los valores más altos del recuento de Staphylococcus sp. se presentaron en el queso-cuajada, con 3,6x107 y 2,9x107 ufc/g en 2008 y 2009 respectivamente, mientras que los menores recuentos se exhibieron en queso mozzarella y cabra, en un orden de magnitud de 2,4x104 ufc/g en ambos casos. En queso “de mano” Maldonado y Llanca (2008), reportaron valores promedio de 2,9x106 ufc/g de Staphylococcus spp. mientras que en queso blanco fresco semi- duro Díaz y González (2001), reportan contenidos de S. aureus de 1,5x105 ufc/g.

En cuanto al contenido de BAL, los menores recuentos en los dos periodos de tiempo fueron obtenidos en queso mozzarella con 3,2x104 y 3,9x105 ufc/g en 2008 y 2009 respectivamente. Los valores más altos en el periodo mayo-junio de 2008 se presentaron en la cuajada, mientras que en el periodo 2009 se encontró un mayor número de bacterias ácido lácticas en el queso de cabra (Figura 4.1). El recuento general de las BAL en los seis tipos de queso estuvo comprendido entre 3,2x104 y 4,9x106. Ferrer et al. (1987), reportan en queso tipo palmita recuentos de 1x109 ufc/g de Lactobacillus sp.

En cuanto a la comparación estadística de los datos, el análisis de varianza para el recuento (ufc/g) de Pseudomonas sp. (Apéndice A.II) determinó que los factores tipo de queso y periodo tienen efecto sobre el contenido de Pseudomonas sp., sin embargo es la interacción de estos dos factores la que presenta un mayor efecto (P=0,0000). El gráfico de interacción que se presenta en la Figura 4.2a señala que los quesos cuajada, mozzarella, y cabra presentaron un recuento de Pseudomonas sp. superior en el periodo mayo-junio de 2008.

Figura 4.2 Gráficos de interacción del tipo de queso y periodo sobre el recuento en Log (ufc/g) de los grupos de microorganismos evaluados. a) Pseudomonas sp., b) coliformes, c) Enterococcus sp., d) Staphylococcus sp. y e) BAL.

Contrario a lo encontrado en el queso guayamano; en el queso guayanés por su parte, no se establecieron diferencias significativas en el recuento en los dos periodos de tiempo. El gráfico de interacción para el recuento de coliformes Figura 4.2b reveló que se presentaron diferencias estadísticamente significativas (P=0,0000) entre el queso de cabra y los cinco quesos restantes en el periodo mayo-junio de 2008.

El ANOVA empleado en el análisis de los resultados del recuento de Enterococcus sp. determinó que la interacción de los factores tipo de queso y periodo posee un efecto estadísticamente significativo (P=0,0000) en el recuento de este grupo de bacterias. El gráfico de interacción que se observa en la Figura 4.2c exhibe diferencias estadísticamente significativas entre el queso de búfala y los quesos guayamano, mozzarella y cuajada en el periodo mayo-junio de 2008, mientras que en el periodo febrero-marzo de 2009 el queso guayamano presentó el mayor recuento de Enterococcus sp. y junto al queso de búfala presentaron diferencias estadísticamente significativas, respecto a los demás quesos analizados (Apéndice A.II).

En el recuento de Staphylococcus sp. se presentaron diferencias estadísticamente significativas (P=0,0274) entre la cuajada y los demás tipos de queso en los dos periodos de tiempo, la prueba de rangos múltiples de Duncan determinó que a excepción de la cuajada y el queso guayamano, los demás quesos no presentaron diferencias estadísticamente significativas (P=0,1271) en el recuento de Staphylococcus sp. en los dos periodos de tiempo, estos resultados se presentan en la Figura 4.2d.

El análisis de varianza del recuento de bacterias ácido lácticas en los seis tipos de queso determinó que existe un efecto del factor tipo de queso sobre el recuento de las BAL, mientras que el factor periodo no mostró efecto estadísticamente significativo (0,2898); sin embargo la interacción de los dos factores si presentó un efecto significativo (P=0,0147) sobre el recuento en ufc/g de este grupo bacteriano. El queso mozzarella fue el único que no presentó diferencias significativas (P=0,2898) en el recuento de BAL en los dos periodos de tiempo.

De manera global, los valores promedio del contenido de microorganismos fueron elevados (>104 ufc/g) en todos los quesos en los dos periodos de tiempo, lo que podría indicar el empleo de una materia prima de baja calidad microbiológica, ó una deficiencia de los sistemas de

higiene utilizados en la elaboración de queso blanco fresco, sin embargo, Ferrer et al. (1987), señalan que los altos recuentos de coliformes, Enterococcus sp. y Lactobacillus sp. encontrados en queso tipo palmita elaborado con leche sin pasteurizar sugieren un importante papel de estos microorganismos en la determinación de las propiedades organolépticas del mismo.

4.2 Identificación de los aislados

Como resultado del análisis microbiológico de los seis quesos bajo estudio en los dos periodos de tiempo evaluados, se obtuvieron 175 aislados bacterianos, los cuales se agruparon según la similitud de sus características morfológicas macroscópicas observadas sobre medios de cultivo diferenciales, mediante la utilización de un dendograma que se presenta en la Figura 4.3. En este se observa la presencia de 3 grupos básicos (Grupo I, II y III) que integran 19 subgrupos, de los cuales se seleccionados al azar 20 aislados que conformaron la colección de trabajo, del primer grupo se eligieron 7 aislados (141, 2, 175, 58, 157, 168, 169), del segundo grupo por poseer mayor número de subgrupos se escogieron 11 aislados (4, 152, 165, 153, 31, 162, 171, 78, 160, 95, 170) y del tercero por ser el más pequeño se seleccionaron solo 2 aislados (39, 159). Sin embargo, la distribución de los aislados en los diferentes subgrupos pudo verse afectada por el hecho de elaborar el dendograma en base a las características de los aislados sobre varios medios de cultivo (diferenciales) y no sobre un único medio, adicionalmente el número de aislados escogidos pudiera no ser representativo de la muestra inicial (175 aislados), por lo que para futuras investigaciones se recomienda utilizar un único medio para el análisis de las características morfológicas de los aislados y tomar una muestra de trabajo mayor (superior a 50 aislados). Adicional a estas consideraciones, pudiera realizarse un screening de los 175 aislados en cuanto a su capacidad para producir aminas por medio de la prueba de descarboxilación de aminoácidos o por medio de pruebas orientativas como Gram, catalasa y oxidasa que permitieran una posterior agrupación.

Las características morfológicas macroscópicas de los 175 aislados utilizadas para la elaboración del dendograma se presentan en el Apéndice A.III.

La identificación de los veinte aislados bacterianos seleccionados se realizó a partir de cultivos jóvenes en fase estacionaria (14 a 20 h de incubación), previamente activados mediante dos

Figura 4.3 Dendograma porcentaje de similitud de 175 aislados bacterianos respecto a sus características morfológicas macroscópicas observadas sobre medios de cultivo diferenciales.

repiques. Se realizaron pruebas orientativas que permitieron agruparlos de acuerdo a su morfología microscópica, a la presencia o no de la enzima citocromo oxidasa (prueba oxidasa), y catalasa. Una vez realizada esta separación se definieron cuatro grupos, al primero pertenecieron los aislados con morfología microscópica en forma de bacilos, Gram negativos, catalasa positivos y oxidasa negativos o positivos y que fueron identificados empleando el sistema Api®20E. El segundo grupo estuvo integrado por cocos Gram positivos, catalasa positivos y oxidasa negativos, los cuales fueron identificados con el sistema Api®Staph. Un tercer grupo estuvo conformado por cocos Gram positivos, catalasa negativos y oxidasa negativos que se identificaron mediante la galería Api®20Strep y el cuarto grupo, integrado por dos aislados, con características morfológicas microscópicas de bacilos Gram positivos, catalasa negativos y oxidasa negativos fueron identificados con el sistema Api®50CH. El total de aislados identificados fue de 19 debido a que uno se contaminó y fue imposible su recuperación. Los resultados de la identificación arrojados por el sistema Api®web se presentan en el Apéndice A.IV.

La identificación del primer grupo conformado por siete aislados, a través del sistema Api®20E determinó para tres de ellos (95, 58 y 2) como taxón significativo Escherichia coli 1, estos aislados eran provenientes de los quesos cuajada, cabra y guayamano respectivamente y pertenecieron al periodo mayo-junio de 2008, para el aislado 58 el sistema Api®web arrojó el taxón significativo de Escherichia coli 1 con un porcentaje de identificación de 99,9%, pero con perfil dudoso, debido a la presencia de un resultado positivo en la prueba de Voges- Proskauer, por lo que la prueba fue repetida obteniendo un resultado negativo que confirmó la presencia de Escherichia coli 1. Los aislados identificados con el sistema Api®20E junto con veintiséis cepas de referencia fueron analizados mediante un dendograma que permitió agruparlos según su porcentaje de similitud en base a diecinueve pruebas bioquímicas (Figura 4.4 y Apéndice A.VIII). Se puede observar que existe una diferenciación clara (% de similitud inferior a 60) entre el grupo al que pertenecen los aislados 141, 162, 170 y 171 y el de los aislados 58, 95 y 2, que presentaron un porcentaje de similitud de 100% respecto a la cepa de referencia de E. coli.

Escherichia coli es una de las bacterias más abundantes en el tubo digestivo de mamíferos, que en condiciones normales constituye una parte esencial de la biota bacteriana humana. EL

IMViC es una fórmula habitual aplicada para su identificación donde: I, producción de indol; M, reacción del rojo de metilo; V, reacción Voges-Proskauer (producción de acetoína); y C, utilización de citrato, designa el tipo de E. coli, así un IMViC + + - - señala a E. coli tipo I, mientras que IMViC - + - - es característico de las cepas de E. coli tipo II (Jay, 2000). La presencia de E. coli en los quesos cuajada, cabra y guayamano podría relacionarse con prácticas higiénicas deficientes, el uso de leche de baja calidad o una inadecuada manipulación del producto. Aray (2002), reporta una incidencia de E. coli de 20% en 30 muestras de queso telita comercializado en mercados populares de la ciudad de Caracas, relacionando su presencia con una contaminación fecal y sugiriendo la posible presencia de otros patógenos entéricos en el queso bajo estudio, el mismo autor confirma la presencia de dos cepas de E. coli O157:H7.

El aislado 141 fue identificado como Burkholderia cepacia con un porcentaje de identificación de 95,8%, este aislado era proveniente del queso de búfala analizado en el periodo febrero- marzo de 2009. En la Figura 4.4 se observa una clara diferenciación con un porcentaje de similitud inferior a 80% entre este y los aislados 162, 170 y 171.

Figura 4.4 Similitud entre los aislados pertenecientes a las Enterobacterias y otros bacilos Gram negativos. Con 26 cepas de referencia (Holt et al., 1994), 8 aislados y 19 pruebas

bioquímicas.

Burkholderia cepacia, o Pseudomonas cepacia, es un grupo de bacterias Gram negativas (no fermentadoras), aerobias, productoras de catalasa; descrita como patógeno de humanos causantes frecuentemente de neumonía en pacientes con debilidad pulmonar. Descrito en 1950 como patógeno de plantas, especialmente encontrado en cebollas y ampliamente distribuido en el suelo y el agua, puede sobrevivir prolongados periodos en ambientes húmedos, su presencia en el queso fresco puede estar asociada a inadecuadas prácticas de procesamiento (Gil, 2001).

Los tres aislados restantes (170, 171, y 162) obtuvieron el perfil de buena identificación en el sistema Api®20E para el género Pseudomonas, por tal razón fue necesario aplicar las pruebas complementarias sugeridas por el sistema (crecimiento a 42 °C, crecimiento en Tween 80, reducción de nitrato y producción de N2), adicional a la prueba de fluorescencia bajo luz UV,

las cuales determinaron que los tres aislados correspondían a la misma especie (Apéndice A.IV.), y fueron identificados como presuntivos de Pseudomonas fluorescens, dos de ellos provenían de queso guayanés y uno de queso guayamano analizados todos en el periodo febrero-marzo de 2009. Los aislados 170 y 171 obtuvieron porcentajes de identificación por el sistema Api®web de 75,3% para Pseudomonas fluorescens/pútida y de 23,2% para Pseudomonas aeruginosa como taxón significativo. En la Figura 4.4 se observa que estos dos aislados presentan un porcentaje de similitud de 100%. Mientras que el aislado 162 obtuvo un porcentaje de identificación de 90,7% para Pseudomonas fluorescens/pútida y de 8,2% para Pseudomonas aeruginosa.

Pseudomonas fluorescens es un bacilo Gram negativo, recto o ligeramente curvado que comúnmente se encuentra en suelo y agua, es incapaz de formar esporas y crece aeróbicamente, la temperatura óptima de crecimiento es de 25 a 30 ºC, aunque puede crecer desde los 5 hasta los 42 ºC aproximadamente. No crece bajo condiciones ácidas (pH ≤ 4,5) prefiriendo para su multiplicación el pH neutro, posee un pigmento fluorescente (fluoresceína) que la hace visible bajo la luz ultravioleta (Madigan, 2006). Forma parte de las denominadas bacterias de la putrefacción debido a que segrega enzimas proteolíticas resistentes al calor, que pueden descomponer las proteínas en amoniaco, produce además lipasas termorresistentes que la hacen indeseable en leche y productos lácteos (mantequilla, quesos) donde comúnmente se encuentra como microbiota contaminante proveniente de estiércol, piensos y agua (López, 2003).

Dos de los aislados pertenecientes al segundo grupo (31, 165), obtuvieron un perfil de buena identificación por el sistema Api®Staph en el género Staphylococcus, se les aplicaron dos de las pruebas complementarias sugeridas por el sistema Api®web (oxidasa y coagulasa), luego de las cuales se encontró que ambos aislados pertenecían a la misma especie y fueron identificados como presuntivos de Staphylococcus sciuri, el aislado 31 era proveniente de queso de búfala del periodo mayo-junio de 2008 y el aislado 165 de queso guayanés del

periodo febrero-marzo de 2009. El aislado 153 fue identificado como Staphylococcus carnosus con un porcentaje de identificación de 99,9% y el aislado 152 como Staphylococcus xylosus con un porcentaje de identificación de 85,9%, ambos aislados eran provenientes de queso guayamano del periodo febrero-marzo de 2009. Los resultados de la identificación se presentan en el Apéndice A.IV. Estos cuatro aislados junto con veintiséis cepas de referencia del género Staphylococcus fueron analizados mediante el dendograma que se presenta en la Figura 4.5, en el que se observa que el aislado 31 exhibe una similitud de aproximadamente 96% con las cepas de referencia S. lentus, S. gallinarum y S. equorum mientras que con la cepa S. sciuri con la cual fue relacionado en la identificación solo existe un 88% de similitud. Por su parte el aislado 165 posee aproximadamente 94% de similitud con las cepas S. intermedius al igual que con el grupo conformado por S. aureus, S. cromogenes, S. hycus y S. lugdunensis, mientras que con la cepa de referencia S. sciuri solo posee un 88% de similitud, aunque por el sistema de identificación Api obtuvo un porcentaje de identificación de 76,1% para S. sciuri y de 19,7% para S. aureus como taxones significativos y de 2,4% para S. xylosus como taxón secundario; con este último existe una similitud de 90%. El aislado 152, identificado como S. xylosus presentó un porcentaje de similitud de 90 con la cepa de referencia S. xylosus, mientras que con el grupo conformado por la cepas de referencia S. lentus, S. gallinarum, S. equorum y S. arlettae al igual que con el aislado 31 el porcentaje de similitud es de aproximadamente 96%.

El aislado 153, identificado como S. carnosus presentó un 94% de similitud con las cepas de referencia S. carnosus y S. caseolyticus, los que según el mismo dendograma (Figura 4.5) poseen una similitud del 100%, dicho resultado puede deberse al hecho que en la construcción de este se prescindió de algunas pruebas de asimilación de azúcares que pueden inferir en la diferenciación entre dos especies.

Staphylococcus sciuri se distribuye ampliamente en la naturaleza, puede ser aislado de una gran variedad de animales y de productos de origen animal, así como de humanos, donde es responsable de enfermedades como endocarditis, peritonitis, shock séptico, infección del tracto urinario, enfermedad inflamatoria pélvica y de las infecciones de las heridas. Se ha reportado que algunas cepas patógenas de S. sciuri son responsables de mastitis en rumiantes como cabras y vacas, a la vez que resulta ser altamente patógeno en lechones y ratones (Shixi

et al., 2007). Su presencia en bovinos y caprinos durante el ordeño puede ser la causa de su existencia en las muestras evaluadas.

Figura 4.5 Dendograma para el género Staphylococcus sp. con 26 cepas de referencia (Holt et al., 1994), 4 aislados y 13 pruebas bioquímicas.

Los cocos Gram positivos catalasa positivos tienen una gran importancia en la tecnología de carnes, puesto que son utilizados como cultivo iniciador en productos tipo peperoni, salami, mortadela y salchichas curadas siendo las especies más utilizadas Staphylococcus carnosus, S. xylosus y Kokuria varians. Su presencia en quesos puede estar relacionada con contaminación cruzada durante el almacenamiento y comercialización en los centros de expendio.

Seis de los siete aislados del tercer grupo (175, 169, 160, 4, 39 y 157) identificados mediante galerías Api®20Strep fueron reconocidos como Enterococcus faecalis, con porcentajes de identificación de 99,3% para los primeros cuatro aislados, los cuales fueron obtenidos de los quesos guayamano 2009, cabra 2009, mozzarella 2009 y búfala 2008 respectivamente, mientras que el aislado 39 era proveniente de queso de cabra del periodo mayo-junio de 2008 y obtuvo un porcentaje de identificación de 88,7%.

El aislado 157 obtuvo buena identificación en el género Enterococcus, sin embargo se le aplicó una prueba complementaria para la diferenciación de este género (Manero y Blanch, 1999), resultando presuntivo de Enterococcus faecalis, dicho aislado fue obtenido de queso guayanés en el periodo febrero-marzo de 2009. En la Figura 4.6 se observa que existe un similitud de 100% entre los aislados 160, 4, 169 y 175 y de más del 90% entre estos y los aislados 39, 157 y 168. La similitud de los 7 aislados evaluados con la cepa de referencia E. faecalis es de aproximadamente 95%, también se hace visible una asociación de más del 80% entre los aislados objeto de estudio y la mayoría de cepas de referencia y solo existe una marcada diferencia con E. saccharolyticus cuando se evalúan 20 pruebas bioquímicas.

El hábitat normal de Enterococcus faecalis es el tubo digestivo de animales de sangre caliente, es indicador de contaminación fecal, y su presencia en los alimentos indica falta de higiene o deficientes condiciones de conservación, excepto en alimentos en los que interviene como