HBeAg

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La detección cualitativa de HBeAg se realizó mediante la técnica de EQL de Laboratorios Roche (HBeAg) en el analizador COBAS e 601.

En este técnica se realiza en dos pasos, en el primer paso la muestra es incubada con un anticuerpo monoclonal especifico anti-HBe y un anticuerpo monoclonal anti-HBe específico marcado con quelato de rutenio formando un complejo sándwich. En el segundo paso se adiciona micropartículas cubiertas con estreptavidina, el complejo formado se une a la fase sólida por interacción entre la biotina-estreptavidina.

La mezcla el traslada a la célula de lectura por magnetismo donde se fijan al electrodo y al aplicar una corriente eléctrica se produce una reacción quimioluminiscente cuya emisión de luz se mide en un fotomultiplicador, el software calculara automáticamente los resultados como reactivo (> 0.9) o no reactivo, ver resultados (Anexo 5).

4.2.4 Anti-HBs

La determinación de anti-HBs para las muestras provenientes de la FCI-IC se realizó utilizando la técnica de EQL de Laboratorios Roche (AHBsAg) en el analizador COBAS e 411.

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Esta técnica se realiza en dos pasos, en la primero la muestras es incubada con HBsAg (ad/ay) biotinilado y con HBsAg (ad/ay) marcados con quelato de rutenio formando un complejo sándwich. En el segundo paso, se incorporan micropartículas recubiertas con estreptavidina, este complejo se fija a la fase solida por interacción entre la estreptavidina biotina.

La mezcla de reacción es trasladada a la célula de lectura donde, por magnetismo, las micropartículas se fijan temporalmente a la superficie del electrodo. Al aplicar una corriente eléctrica definida se produce una reacción quimioluminiscente cuya emisión de luz se mide directamente con un fotomultiplicador. Los resultados se generan a partir de la curva de calibración.

Interpretación de los resultados: las muestras con concentraciones < 2 UI/L son consideradas no reactivas y las muestras con concentraciones ≥ 10 UI/L son consideradas reactivas con títulos protectores, ver resultados (Anexo 8).

La determinación de anti-HBs para las muestras provenientes del LSPB se

realizó mediante la técnica de ELFA (VIDAS® anti-HBs Total Quick). Los anticuerpos de la muestra diluida se fijan a los antígenos ad y ay biotinilados fijados en la fase sólida, este complejo se unirá a través de la biotina con el conjugado estreptavidina fosfatasa alcalina, el revelado de la prueba se evidencia por acción de la fosfatasa alcalina sobre el sustrato (4metil-umbeliferil fosfato) emitiendo una fluorescencia emitida a 450 nm.

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Interpretación de los resultados: el valor de la señal de fluorescencia es proporcional a la cantidad de anticuerpos. Títulos < 8 Negativo, ≤8 titulo ≤12 indeterminado y >12 Positivos.

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4. RESULTADOS Resultados e interpretación.

Tabla 5. Resultados de las pruebas serológicas e interpretación

Resultados n= 84 % Interpretación

HBsAg Reactivo-HBsAg Confirmatoria

Positiva, HBeAg No Reactivo y Anti-HBsAg No Reactivo

20 23,8% Mutantes

precore

HBsAg Reactivo-HBsAg Confirmatoria

Positiva, HBeAg Reactivo 2 2,4% Cepas Salvajes

HBsAg Reactivo-HBsAg Confirmatoria

Negativa 3 3,6% Falso Positivo

HBsAg Negativo, Anti-HBc Reactivo 59 70,2% Probable

mutantes pre-s

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Tabla 6. Características demográficas de las mutantes precore (n=20)

Edades _{Hombres Mujeres Total}

18-30 _{7 (53,8%) 1(14,0%) 40%}

31-40 _{3 (23,0%) 3(43,0%) 30%}

41-50 _{2 (15,4%) 0 (0%) 10%}

51-65 _{1(7,7%) 3(43,0%) 20%}

Total _{13(100%) 7(100%) 100%}

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5. DISCUSIÓN

Durante el desarrollo de la Hepatitis B se presentan marcadores serológicos que indican progresión de la enfermedad, aclaramiento viral o contactos virales previos de los cuales se ha obtenido inmunidad serológica (11, 22, 23, 34, 45); sin embargo esto se espera en la mayoría de las personas infectadas con el virus, pero cuando estas infecciones están asociadas a mutaciones en el PBC o en la región precore del VHB el cual tiene un efecto sobre la producción de anticuerpos, la expresión de HBeAg, la severidad de la enfermedad y el comportamiento serológico es diferente. Las pruebas utilizadas actualmente para la detección del VHB en donantes de sangre se basan en la determinación de HBsAg y anticuerpos Anti-HBc, y no se realizan pruebas adicionales para la detección de mutantes precore.

En este estudio se presentan los resultados obtenidos en donantes de sangre que habían sido seleccionados con criterios muy estrictos relacionados con hábitos saludables y relaciones sexuales responsables en los cuales no se esperaba encontrar marcadores que indicaran contacto previo con el VHB; sin embargo 2 (6%) de los participantes reportaron haber tenido hepatitis en edad adulta, estos datos no fueron consignados en el formulario que se debe diligenciar antes de la donación por omisión de los donantes, pero fueron registrados en la ficha técnica

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(Anexo 1). Del total de donantes de sangre 20 (23,8%) presentó HBsAg positivo, Anti-HBc Reactivo, HBeAg y Anti-HBs no Reactivo que corresponden a mutantes precore con un alto riesgo de desarrollar hepatitis crónica y sus complicaciones a corto plazo. Las muestras de la FCI que presentaron estos marcadores serológicos 2/20 son compatibles con las mutantes precore, que estaban cursando con un proceso crónico de más de un año de evolución evidenciado por pruebas serológicas reactivas para HBsAg y Anti-HBc realizado el año inmediatamente anterior al estudio. Las muestras del LSPB que tuvieron este comportamiento serológico 18/20, no se pudo evidenciar el curso clínico de la enfermedad pues no se tenía registros previos sin embargo con este algoritmo hay una alta probabilidad que los sueros examinados tenga la mutante precore del VHB que podría confirmarse con la determinación de Anti-HBe el cual no se determinó en este estudio por limitaciones económicas y que en un trabajo posterior serán comprobados por biología molecular.

La mayor expresión de las mutantes precore se evidenciaron en hombres que en mujeres (de las 20 muestras positivas para mutantes precore 13 se evidenciaron e hombres y 7 en mujeres), si tenemos en cuenta que el 53,5% de los participantes del estudio fueron mujeres y el 46,5% hombres, se esperaba que la presencia de mutantes tuviera un comportamiento similar al porcentaje de participación; por otra parte en Bogotá las donaciones de sangre para el año 2009 fueron de179.697 de los cuales 95.579 (53,2 %)fueron hechas por hombres y 84.097 (46,8%)por mujeres lo cual no sería un factor de impacto importante para ser tenido en cuenta

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frente a los resultados obtenidos, sin embargo consideramos que se requieren estudios con un número de muestras más representativo para determinar si la presencia de mutantes precore está asociada al género. Los estudios previos realizados en pacientes con hepatitis crónica, cirrosis hepática y hepatocarcinoma muestran una fuerte asociación con las mutantes precore y una prevalencia que aumenta proporcionalmente con la edad, sin embargo en nuestro estudio encontramos que la mayor prevalencia (70%) se observó en el grupo entre los 18 y 40 años, este resultado está asociado con el grupo poblacional utilizado en este estudio en el cual la mayor población de donantes de sangre son adultos jóvenes (29, 34, 38).

las mutantes precore podrían ser una de las causas probables del aumento de la incidencia de la Hepatitis B en Colombia donde paso del 2,6 en el año 2007 a 3,7 en el año 2010, con un aumento de casos reportados en el año 2011 del 26% con relación al año 2010, sin que se tenga en cuenta ni se haya tomado medidas sanitarias por parte de Salud Pública para el control de la Hepatitis B asociada a mutantes precore, teniendo en cuenta que la vacuna no protege de las infecciones causadas por cepas mutantes creando una falsa sensación de seguridad en las personas vacunadas (11,12).

La expresión de mutantes precore se ha relacionado especialmente con los genotipos B y C , dado que la mayoría de los estudios se han realizado en países asiáticos donde la hepatitis tiene una alta prevalencia y en pacientes que presentan, hepatitis crónica, cirrosis y hepatocarcinoma (10, 29, 31, 34, 35, 37).

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En Colombia no hay estudios que evidencien la presencia de mutantes precore en ninguna población, los estudios han estado orientados a determinar genotipos, donde se ha encontrado una mayor expresión del genotipo F, sin embargo el grupo poblacional de muestra ha sido muy pequeño por lo cual no representa la realidad de las cepas circulantes en nuestro país (25, 26).

Numerosos estudios evidencia la fuerte asociación entre las mutantes precore y la hepatitis crónica, cirrosis y hepatocarcinoma como lo se muestran a continuación.

Estudios realizados previamente en pacientes con HBsAg positivo y HBeAg negativo han demostrado una fuerte asociación con la mutación G1896A, T1762/A1764 en pacientes con hepatitis crónica, cirrosis hepática Tong y Col (29), lo cual contribuye a una progresión severa de la enfermedad, adicionalmente se asociaron las mutaciones del PBC, con HCC, además de las mutaciones A1753T, T1762A/T1764C con una rápida progresión de la enfermedad y la C1766T con hepatitis fulminante. En ese estudio se determinó la prevalencia en donantes de sangre con HBsAg positivo y HBeAg negativo y su relación con las mutantes precore y PBC, su posible asociación con la progresión de la Hepatitis B. El 19% de las muestras analizadas podrían estar asociadas a mutaciones en el gen precore y el 1% a mutaciones en el PBC; de acuerdo a los estudios realizados por Chen y Col (35) se encontró la mutación 1896 en un 51,5% en un 66% la C1799 y en un 45 % la doble mutación T1762A/A1764 en la población estudiada de portadores crónicos, portadores asintomáticos y pacientes con cirrosis hepática y marcadores negativos para el HBeAg. De los pacientes que

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presentaban cirrosis hepática 86,9% expresaban la doble mutación del promotor y el 69,6% expresaban la mutación del precore 1896, de los pacientes con hepatitis crónica el 72,2% expresaban la mutación C1799 al igual que el 73,7% de los asintomáticos; estos estudios se correlacionan con los resultados obtenidos de un grupo de donantes de sangre en Escocia donde se observó una asociación del 55% entre los donantes que presentaron serología reactiva para HBsAg y negativa para HBeAg con la mutación 1896, sin embargo la expresión de la mutación 1896 en donantes con HBeAg positivo solo fue del 22% con lo cual se concluye que la mutación 1896 está fuertemente asociada con el HBeAg negativo (47). Estos resultados deben tenerse en cuenta para pronóstico y sobrevida de los pacientes crónicos quienes pueden desarrollar cirrosis hepática del 2 -6% al año cuando expresan HBeAg positivo y de 8-10% cuando el HBeAg es negativo, de igual manera los pacientes con cirrosis que se descompensan del 55 al 70% sobreviven un año y del 14 al 28% lo hacen a los 5 años; en los portadores crónicos los factores más asociados al desarrollo de hepatocarcinoma son la confección con otros virus, consumo de alcohol replicación viral, genotipo C y la mutación en la región PBC (23).

Otros estudios realizados por Tong y Col. (29, 31) evidenciaron que la mutación más asociada con el desarrollo de hepatocarcinoma es la A1762/T1764 del PBC en un 77,7% de los pacientes, sin embargo también fue identificada en el 21,2% de los portadores crónicos, la mutación A1896 se encontró en 46% de los pacientes con hepatocarcinoma, lo cual evidencia que estas mutaciones pueden

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estar asociadas con el desarrollo de cáncer de hígado; en otro estudio realizado por el mismo autor en una población de 400 pacientes con hepatitis crónica encontró que el HBeAg negativo estaba asociado con la mutación precore 1896 en el 69,7% de los casos y la mutación 1762/1764 en el 45,2% de los mismos.

Un estudio realizado por Huang y Col. (34) en 79 Taiwaneses con hepatitis crónica con HBsAg y Anti-HBe positivo y HBeAg negativo encontraron una fuerte asociación de las mutantes G1896A( 92,5%) y C1859T (100%) con el genotipo B y de C1858T (92,3%) y de A1762T/G1764A (73,1%) con el genotipos C. La caracterización molecular genotípica hecha en Colombia por Alvarado y Col (26) en 143 donantes del Banco Nacional de Sangre de la Cruz Roja Colombiana entre el año 2003 y 2007 que presentaban marcador serológico positivo para HBsAg en los cuales se identificó los genotipos F en un 77%, G en 7,7% y A en el 15,3%, estos hallazgos confirman los resultados encontrados por Devesa y Col (25) en amerindios de Venezuela (#46) y donantes de sangre de Bogotá (#39) y Bucaramanga (#10) donde se identificó los genotipos F en un 82%, A (11%) y D en el 7% para la población caracterizada en Venezuela; y F en un 84%, A en un 3%, D en un 10% y C en un 3% para los donantes de sangre de Bogotá; para los donantes de Bucaramanga se identificó el genotipo F en el 100%. Los resultados de los estudios realizados en Colombia fueron hechos en zonas de moderada endemia y con un tamaño muy pequeño de muestra lo cual no representa la población en general por lo tanto se sugiere realizar estudios con una amplia muestra que evidencie los genotipos circulantes representativos para la población

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colombiana. Estos estudios pueden adicionalmente arrojar resultados sobre el comportamiento de las mutantes en nuestra población y su respectiva asociación con la patogenicidad del VHB en Colombia.

De las muestras analizadas en este estudio también se encontró que 59 (70.2%) fueron HBsAg negativo con Anti-HBc positivo, estos marcadores serológicos pueden estar asociados a contactos infecciosos previos , (23, 45, 50), o debido a infecciones con cepas con mutaciones pre s, con diferentes niveles de DNA VHB en suero, algunos estudios reportan que valores mayores a 200UI/ml deben ser tenidos en cuenta y clasificados en este grupo (53), aunque no es claro la influencia en el desarrollo clínico de la hepatitis, se cree que puede conducir a una patogenicidad más agresiva del VHB con desarrollo de cirrosis hepática y hepatocarcinoma y se hace necesario realizar pruebas más específicas que puedan dar un diagnóstico definitivo y confiable del estado asintomático o si realmente los resultados se deben a un contacto infeccioso previo sin complicaciones futuras o a mutaciones pre s (44, 47, 50, 53). Un donante con marcador positivo para Anti-HBc asociado a mutantes pre s puede cursar con un proceso infeccioso y convertirse en portador que facilite la transmisión del virus a través de las transfusiones sanguíneas, pues esta prueba no es de carácter obligatorio en el país y no todos los bancos de sangre hacen determinación serológica para este marcador.

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Solo 2,4% de las muestras analizadas tuvieron un comportamiento serológico que corresponde a cepas salvajes, estos datos confirman la gran variabilidad que presenta el virus y que se refleja en un comportamiento serológico diferente al esperado, razón por la cual deben tomarse las medidas necesarias para hacer una identificación adecuada y el seguimiento correspondiente de cepas mutantes que son la que se presentan con mayor frecuencia y tienen un alto impacto clínico. A pesar de haber utilizado una técnica altamente sensible en las determinación del HBsAg se presentaron 3,6% de falsos positivos, que tienen un impacto económico al descartar componentes sanguíneos innecesariamente y donantes de sangre potenciales que no pueden ser aceptados nuevamente como donantes.

6. CONCLUSIONES

La mutante precore HBeAg- está presente en el 23,8% de los donantes de sangre estudiados con una mayor expresión en hombres (13 hombres y 7 mujeres de las muestras positivas para mutantes precore) de 18 a 40 años, que están expuestos a sufrir futuras complicaciones relacionadas con el VHB.

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7. PERSPECTIVAS Y APLICACIONES

La siguiente etapa de investigación es la amplificación y secuenciación de DNA para identificar las mutaciones encontradas en los donantes de sangre.

Utilizando los resultados obtenidos en este estudio y haciendo amplificación y cuantificación del DNA permitirá la búsqueda e identificación de probables mutantes pre s. Estudios previos advierten la presencia de estas mutantes en donantes de sangre con marcador serológico positivo para Anti-HBc.

De acuerdo a los resultados obtenidos, debe considerarse si hay que hacer pruebas adicionales que permitan evidenciar la presencia de mutantes en donantes de sangre que si no son diagnosticados oportunamente se convierten en portadores crónicos aumentando la prevalencia de la Hepatitis B en Colombia

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