HDAC6, NUEVA PROTEÍNA IMPLICADA EN LA FORMACIÓN DEL SEGMENTO INICIAL DEL AXÓN

3.1 LA IMPORTANCIA DE LAS MODIFICACIONES POSTTRADUCCIONALES DE TUBULINA EN EL SEGMENTO INICIAL DEL AXÓN

Aunque los MT acetilados y detirosinados se localizan aparentemente a lo largo de la neurona de forma homogénea, se asocian de forma específica a la estructura del SIA, como demuestra su restricción específica en SIA después de una extracción con Tritón X-100 (fig. R1). Por el contrario, la tubulina tirosinada es más lábil al tratamiento con Tritón X-100 y desaparece de la gran mayoría de segmentos iniciales. Estos resultados concuerdan con ensayos previos donde ensayos de inmunocitoquímica reflejan una proporción o balance de De-tyr/Tyr-tubulina superior en los MT del SIA (Konishi and Setou, 2009). Igualmente, experimentos realizados por nuestro laboratorio establecen que tanto la acetilación como la detirosinación son modificaciones presentes en MT asociados al SIA (Sanchez-Ponce et al., 2011a).

Como hemos comentado en secciones previas, la acetilación y la detirosinación de tubulina son modificaciones relacionadas con la dinámica de unión de kinesinas como KIF5. Hemos visto que estas modificaciones se concentran esencialmente en el axón, durante estadios tempranos, y se asocian específicamente a la red de MT del segmento inicial, pudiendo contribuir al tráfico polarizado de vesículas hacia el axón. Dado que

la barrera de difusión en SIA comienza su formación a partir del tercer día in vitro (Song et al., 2009) la

detirosinación y acetilación de MT axonales podrían dirigir la unión preferencial de KIF5 al axón inicialmente y, una vez formada la barrera de difusión, mecanismos basados en MT continuarían participando en la

regulación del filtro axonal (Arnold, 2009). Adicionalmente este subconjunto de MT en la región proximal

del axón sugiere un recambio y/o translocación de subunidades a tasas mucho más lentas que el resto de

MT axonales (Shea, 1999). La acetilación de α-tubulina es un claro síntoma de estabilidad estructural, y en

un dominio de elevada cohesión y resistencia como el SIA adquiere un mayor significado funcional. Por otro lado, la red de neurofilamentos en el SIA es particularmente densa y estática debido a las interconexiones

con la red de MT (Hirokawa, 1982; Yuan et al., 2009). Todo este conjunto de elementos que conforman el

DIS

CUSIÓN

3.2 EL PAPEL DE HDAC6 EN LA FORMACIÓN DEL SEGMENTO INICICIAL DEL AXÓN

La formación del SIA es un proceso secuencial que se inicia justo después del proceso de especificación axonal, donde la proteína clave que dirige el proceso de anclaje de proteínas específicas en esta región es ankirina G. Nuestros datos muestran que un descenso mantenido en los niveles de expresión de HDAC6 altera la localización restringida de proteínas del SIA, que difunden más allá de la longitud establecida para este dominio. Hemos discutido hasta el momento cómo la función de HDAC6 puede modificar el crecimiento axonal y regular la localización específica de un transportador molecular, KIF5C. Una alteración durante eventos tempranos de elongación y creación de dominios diferenciados podría repercutir en la correcta formación del segmento inicial del axón. Sin embargo, no observamos una pérdida de polaridad específica de proteínas en el SIA, dado que ankirina G sigue localizándose en el primer tramo proximal del axón, lo que nos indica que HDAC6 no es una proteína fundamental en la localización específica de proteínas en el segmento inicial, sino más bien una proteína necesaria para su concentración restringida. Con respecto a la retención en SIA de canales de sodio dependiente de voltaje, sabemos que una vez transportados a membrana son retenidos

específicamente en esta región, por medio de un dominio de interacción con ankirina G (Garrido et al., 2003a;

Garrido et al., 2003b). Por lo tanto, podemos relacionar la pérdida de canales de sodio con una alteración en

la localización restringida de ankirina G. En resumen, nuestros resultados nos permiten sugerir que la pérdida de concentración de ankirina G y canales de sodio dependientes de voltaje es debida a la ausencia de un dominio específico de microtúbulos, con características diferenciadas en el segmento inicial del axón, lo que impide una correcta inmovilización de determinadas proteínas.

De hecho, la inhibición de HDAC6 además de potenciar la acetilación global, supone una pérdida de la distribución específica de α-tubulina acetilada en el SIA después de la extracción con detergente, que aparece distribuida a lo largo del axón (fig. R15). Este no deja de ser un resultado cuanto menos llamativo, pues esta resistencia característica viene definida por la agrupación y cohesión específica de proteínas y

lípidos de membrana en el SIA (Winckler et al., 1999; Garrido et al., 2003b). Podríamos conjeturar que un

nivel anormalmente elevado de la acetilación produce cambios en las propiedades de los MT, que adquieren una resistencia similar a la resistencia del SIA, o bien, que esta propiedad del SIA está conferida por las características especiales de los microtúbulos en el SIA, que servirían de base de anclaje de proteínas que mantienen agrupadas las proteínas de membrana y lípidos. Como consecuencia de estos cambios en las propiedades de los MT axonales se produce una deslocalización de ankirina G, durante los estadios tempranos de formación del SIA, puesto que ankirina G reproduce un fenotipo similar tras la exposición a TSA durante un intervalo de tiempo similar (de 3 a 6 DIV) (fig. R12). Por consiguiente, un cambio en la distribución de ankirina G provoca que otras proteínas que interactúan con ankirina G, como canales de sodio dependiente de voltaje, difundan a lo largo del axón. De hecho ankirina G es capaz de restringir específicamente la

difusión de proteínas que interactúan con ella antes de que se forme la barrera de difusión en SIA (Brachet

et al., 2010).

En relación a la función deacetilasa de HDAC6 sobre otros sustratos, como apuntamos anteriormente, HDAC6 puede producir cambios significativos en la dinámica de polimerización de actina, lo que podría repercutir en la desorganización del segmento inicial del axón y en el anclaje específico de proteínas (Winckler et al., 1999;

Nakada et al., 2003) y organelas asociadas específicamente al SIA, como determinadas cisternas derivadas

DIS

CUSIÓN

En conjunto, la distribución de HDAC6 en la región distal del axón y su ausencia en la porción proximal del axón podrían regular la formación de dominios específicos de microtúbulos en el axón. Mientras que la actividad de HDAC6 en el axón distal puede promover el crecimiento axonal, generando microtúbulos menos acetilados y más dinámicos, su ausencia de la región proximal del axón permitiría la presencia de MT con un mayor grado de acetilación que pueden participar en el mantenimiento del SIA, necesario para el tráfico polarizado axonal y para la localización de proteínas específicas (fig. D1).

Pérdida de ac�vidad de HDAC6

Canales de sodio

voltaje dependientes Ankirina G

Microtúbulos ace�lados asociados al SIA Microfilamentos de ac�na Ac�vidad deace�lasa de HDAC6 A B

4 EL SIA DEPENDE DE LA INTEGRIDAD DE SU RED DE MT ASOCIADOS Y SUS PROPIEDADES VARÍAN EN