Las hemo peroxidasas, son enzimas ubicuas, que participan en numerosos procesos biológicos entre los que destacan la síntesis y degradación de biomasa, la respuesta inmune, la patogenicidad y la detoxificación celular. Se caracterizan por contener un grupo prostético hemo de tipo B (hierro protoporfirina IX) representado en la Figura 1. El centro del cofactor presenta un átomo de Fe (III) pentacoordinado con los nitrógenos del anillo tetrapirrólico de la porfirina y el nitrógeno de una histidina axial situada en su cara proximal, que estabiliza el grupo hemo. El sexto ligando varía a lo largo del ciclo catalítico.
Figura 1. Representación del grupo hemo tipo B (hierro protoporfirina IX). Presenta dos
grupos vinilo ( –CH=CH2), dos propionatos (–CH2–COOH) y cuatro grupos metilo.
Se indican sus distintas caras (α, β, γ y δ) y sus anillos pirrólicos (A, B, C y D). En la imagen de la derecha se muestra la pentacoordinación del grupo hemo con los nitrógenos pirrólicos y la histidina proximal.
Los grupos propionato interaccionan con residuos cercanos formando puentes de hidrógeno que determinan el posicionamiento del grupo hemo. Estos residuos, junto a la histidina proximal, fijan la porfirina a la enzima. Este grupo suele situarse en el “core” de la enzima, en el denominado bolsillo hemo que presenta un número variable de canales, de mayor o menor diámetro, para el acceso de los diferentes sustratos.
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1.1. MECANISMO CATALÍTICO:
Las hemo peroxidasas utilizan el peróxido de hidrógeno como aceptor de electrones para producir la oxidación de los sustratos en dos pasos secuenciales (Welinder 1992) siguiendo el ciclo catalítico que se muestra en la Figura 2.
Inicialmente, la enzima reacciona con un equivalente de H2O2 ocupando la sexta posición de coordinación del Fe (III) en una reacción de óxido-reducción de dos electrones, en la que el H2O2 es reducido a H2O. Esta da lugar al primer intermediario de la reacción con la formación de un centro oxoferrilo (O=Fe[IV]), con el átomo de oxígeno procedente del H2O2, y un radical catiónico porfirínico (+ •) en la mayoría de las peroxidasas, o aminoacídico como en las peroxidasas tipo VP o LiP donde el radical queda ubicado en un triptófano. Este complejo intermedio se denomina compuesto I.
El compuesto I puede oxidar una molécula de sustrato (RH) mediante transferencia electrónica, formándose un radical del sustrato (R•) y se libera un protón. Con la oxidación del sustrato se forma el compuesto II con el Fe4+=O coordinado a la porfirina, que recupera su electrón. Finalmente, el compuesto II es reducido a la forma férrica (Fe3+) mediante la sustracción de un electrón de otra molécula de sustrato y la enzima retorna a su estado de reposo.
Figura 2. Ciclo catalítico del cofactor hemo B. En estado de reposo el grupo hemo Fe (III)
reacciona con H2O2 produciendo un centro oxiferrilo O=Fe (IV) combinado con un
radical porfirínico o aminoacídico (+ •). Este útimo radical oxida una molécula de sustrato (RH) formando el compuesto II (O=Fe [IV]). La oxidación de la segunda molécula de sustrato hace que el grupo hemo vuelva a su estado de reposo.
INTRODUCCIÓN
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Los residuos del entorno distal del grupo hemo que participan en la desprotonación y posterior ruptura heterolítica del enlace O–O del H2O2, varían de unas familias a otras. En las catalasas y ciclooxigenasas son una histidina y una arginina, en hemo peroxidasas de clase II una histidina y una arginina y en las peroxidasas de tipo DyP una arginina y un aspártico (Zamocky et al. 2015). El tipo de aminoácidos presente en la zona distal del grupo hemo puede determinar la accesibilidad de determinados sustratos al centro activo.
1.2. HEMO PEROXIDASAS FÚNGICAS Y PEROXIDASAS DE TIPO DYP:
Los hongos de podredumbre blanca son los organismos más eficientes en la degradación de biopolímeros recalcitrantes como la lignina (Welinder 1992). Para ello secretan peroxidasas de alto potencial redox que catalizan reacciones de oxidación, generando radicales libres o cationes reactivos, que a su vez oxidan lignina, sustratos húmicos y compuestos tóxicos (Liers et al. 2012). Estas enzimas son hemo peroxidasas que pertenecen a la superfamilia de las peroxidasas no animales que abarca distintas clases. La clase II está formada por peroxidasas fúngicas de secreción y se divide en cuatro familias: las lignina peroxidasas (LiP), las peroxidasas dependientes de manganeso o manganeso peroxidasas (MnP), las peroxidasas genéricas (GP) y las peroxidasas versátiles (VP) (Fawal et al. 2013; Zamocky et al. 2014).
Así, la clase II está formada por enzimas exclusivas de hongos basidiomicetos productores de podredumbre blanca, como las lignina peroxidasas responsables de la despolimerización en la degradación de la lignina (Glenn et al. 1983; Tien and Kirk 1983); las manganeso peroxidasas que oxidan el manganeso (II) generando iones (Mn3+) que difunden fácilmente en la estructura de la lignocelulosa aumentando así la biodegradación de lignina (Janusz et al. 2017); y las peroxidasas versátiles que combinan la capacidad catalítica de los otros componentes de esta clase (Ruiz-Dueñas et al.1999). El cuarto tipo lo forman las peroxidasas genéricas (GP) que incluyen peroxidasas no–ligninolíticas de bajo potencial redox capaces de oxidar fenoles sencillos, como la peroxidasa de
Coprinopsis cinerea (CiP) (Baunsgaard et al. 1993)
Las peroxidasas de tipo DyP, pese a una presencia significativa en basidiomicetos lignolíticos, constituyen una nueva clase ya que no presentan relaciones filogenéticas ni estructurales con el resto de hemo peroxidasas. Los análisis de las secuencias nucleotídicas de distintos representantes de esta clase y la presencia de estas enzimas en bacterias termófilas anaerobias facultativas del filo firmicutes o endobacteria, sugieren que las DyP se diversificaron a partir de estos organismos, a hongos y eucariotas inferiores (Zamocky et al. 2015)
La clasificación actual se describe en la base de datos Peroxibase, también denominada Redoxibase (Fawal et al. 2013) y se detalla en la Figura 3.
INTRODUCCIÓN
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Figura 3. Clasificación de las hemo peroxidasas según Peroxibase (Fawal et al. 2013).
Pese a las diferencias mencionadas, las peroxidasas de clase II y las DyP también presentan convergencias en su actividad catalítica con sustratos comunes como los compuestos modelo de lignina o los colorantes (Brown et al. 2012; Fernández-Fueyo et al. 2015; Linde, Ruiz-Dueñas, et al. 2015). En algunos miembros de peroxidasas de tipo DyP, se ha descrito un sitio de unión a manganeso (Mn2+) (Brown et al. 2012; Fernández- Fueyo et al. 2015; Rahmanpour and Bugg 2015), al igual que en las MnP y las VP (Ruiz- Dueñas et al. 2008). Además, en VPs, LiPs y algunos representantes de las peroxidasas de tipo DyP se ha descrito que la oxidación superficial de algunos sustratos voluminosos está mediada por una cadena de transferencia electrónica. Dicha cadena comienza en un radical triptofanilo superficial y finaliza en el grupo hemo (Perez-Boada et al. 2005; Ruiz- Dueñas et al. 2008; Linde, Pogni, et al. 2015; Shrestha et al. 2016).