4. Biomateriales de soporte para el crecimiento celular
4.3. Hidrogel de PEG
El macrómero de PEG (H(OCH2CH2)nOH) es un polímero biocompatible. El hidrogel de
PEG se forma al mezclar 1:1 una solución de PEG-Acrylate (Nektar Therapeutics, Huntsville, AL, EEUU) al 15% con una solución de PEG-Thiol (Nektar Therapeutics) al 7,5%.
Protocolo de sembrado:
- Se preparó una solución acuosa de Triethanolamine (TEOA) (Fluka, St.Gallen, Suiza) a 0,3 M y pH 8,5 y se esterilizó por filtración
- Se preparó una solución de PEG-Acrylate en TEOA al 15% y otra de PEG-Thiol en TEOA al 7,5%. Se pipeteó hasta disolver y se centrifugó a 1200 rpm durante 2 minutos.
- Se pasaron estas soluciones tres veces a través de una jeringa de insulina.
- Se tripsinizaron las células a sembrar y se resuspendieron en medio para tenerlas a una concentración de 1,8·106 células/ml.
- Se depositó en cada pocillo de una placa de 48, 110 μl de suspensión celular. - Se mezclaron 1:1 las soluciones de PEG-Acrylate y PEG-Thiol e inmediatamente se repartieron 300 μl por pocillo.
- Se dejó la mezcla a temperatura ambiente 5 minutos y luego a 37º C y una concentración del 5% de CO2 durante una hora para que acabara de gelificar.
- Se añadió medio hasta llenar el pocillo. Se cambió el medio cada 2 o 3 días.
4.4. Hidrogel de PEG-RGD
Este hidrogel118 ha sido desarrollado por el grupo del Dr. JA Hubbell (Ecole
Polytechnique Fédérale de Lausanne, Lausanne, Suiza). Consiste en macrómeros de polietilenglicol de 4 brazos (Fig. 39) funcionalizados con péptidos de unión sensibles a MMPs y con péptidos RGD que permiten que las células invadan el material. La migración celular depende de la actividad proteasa sobre los péptidos de unión que unen las moléculas de PEG.
Se recibieron, del grupo del Dr. JA Hubbell, alícuotas de PEG-RGD al 7% y alícuotas del péptido de unión liofilizadas y estériles.
Fig. 39. Estructura y composición del polietilenglicol de 4 brazos.
Protocolo de sembrado:
- Se preparó una solución acuosa de TEOA (Fluka) a 0,3 M y pH 8 y se esterilizó por filtración.
- Se tripsinizaron las células a sembrar y se resuspendieron en medio de cultivo a una concentración de 15·106 células/ml.
- Se sumergieron dos portas (por hidrogel a formar) en Sigmacote (Sigma) tres veces, dejando secar los portas antes de sumergir de nuevo.
- Se limpiaron brevemente los portas con etanol al 70%.
- Se unieron cinco cubres (dos juegos de cinco cubres por hidrogel a formar) con cinta adhesiva. Se dejó preparado un porta con Sigmacote y encima un juego de cinco cubres unidos en cada extremo del porta de manera que la parte central del porta quedaba libre.
- Se puso en hielo una alícuota de PEG-RGD 7%, una alícuota de péptido de unión, el TEOA, PBS 1X y se realizó la siembra siempre sobre hielo y deprisa.
- Se añadieron 20 μl de PBS 1X a la alícuota de PEG-RGD al 7%, se vortexó y se dejó otra vez en hielo.
- Se añadieron 49,6 μl de TEOA a la alícuota del péptido de unión, se vortexó y se dejó en hielo.
- Se añadieron 20 μl de la suspensión celular al péptido de unión resuspendido. - Se añadieron 132 μl del PEG-RGD resuspendido en el tubo del péptido de unión, se mezcló y se depositó todo el volumen obtenido en el centro del porta previamente preparado. *
- Se cubrió el porta con el otro porta tratado con Sigmacote y se aseguró con una pinza en cada extremo. Se dejó a 37º C y a una concentración del 5% de CO2 durante
15 minutos.
- Se retiró el hidrogel formado con una espátula y se depositó en un pocillo de una placa de 12 con 1 ml de medio. Se dejó a 37º C y a una concentración del 5% de CO2
durante 30 minutos.
- Se hicieron pequeños geles, a partir del hidrogel formado, con la ayuda de un Biopsy Punch (Stiefel, Madrid, España) y se depositaron en pocillos de una placa de 96 con medio de cultivo. Se cambió el medio cada dos o tres días.
* La mezcla, en lugar de depositarse en el porta, puede ser directamente inyectada en el animal de experimentación, la solidificación del hidrogel tiene lugar en 5 minutos aproximadamente.
4.5. Esferas de alginato
Las gotas gelificadas de alginato se forman al entrar en contacto una solución que contenga NaCl con otra de CaCl2.
Protocolo de sembrado:
- Se prepararon soluciones acuosas de NaCl (Sigma) al 0,15 M y CaCl2 (Sigma) al 100
mM y se esterilizaron por filtración.
- Se preparó una solución de alginato (Low-viscosity alginate, Sigma) al 1,2% en NaCl al 0,15 M y se esterilizó por filtración.
- Se tripsinizaron las células a sembrar y se resuspendieron en la solución de alginato/NaCl para que quedaran a una concentración de 4·106 células/ml.
- Se pasó la suspensión celular a través de una jeringa con una aguja de 23G y se dejó caer gota a gota sobre la solución de CaCl2. Se mantuvieron las gotas en la
solución de CaCl2 durante 10 minutos para que las esferas polimerizaran
completamente.
- Se lavaron las esferas en la solución de NaCl cuatro veces.
- Se lavaron las esferas en medio de cultivo una vez y se dejaron con medio fresco a 37º C y a una concentración del 5% de CO2. Se cambió el medio dos o tres veces en
semana según la proliferación celular.
4.6. Esferas Cytodex
TM3
Las esferas CytodexTM 3 (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia) son
esferas transparentes que miden entre 141-211 μm y poseen una capa de colágeno porcino desnaturalizado sobre la superficie de la matriz porosa.
Protocolo de sembrado:
• Hidratación y esterilización
- Se mezclaron 50-100 ml de PBS 1X por gramo de CytodexTM 3 y se
mantuvieron 3 horas a temperatura ambiente con agitación. - Se lavaron las esferas con PBS 1X.
- Se lavaron 2 veces con etanol al 70%.
- Se incubaron las esferas 24 horas con etanol al 70%.
- Se lavaron con PBS 1X estéril 3 veces y una vez con medio de cultivo.
• Equilibrio
- Se colocaron las esferas hidratadas en medio de cultivo fresco 30 minutos a 37º C y a una concentración del 5% de CO2 antes de sembrarlas.
• Siembra del material
- Se colocaron las esferas hidratadas en 1/3 del volumen final de cultivo (0,5-5 mg/ml).
- Se tripsinizaron las células a sembrar y se añadieron a las esferas quedando a una concentración de 4,6·105 células/mg CytodexTM 3. Se mantuvo el cultivo
en agitación continua (40-60 rpm) a 37º C y a una concentración del 5% de CO2.
- Se añadió el resto del medio a las seis horas del inicio del cultivo. - Se cambió el 50% del medio cada tres días.
4.7. Esferas PAMs
Las esferas farmacológicamente activas (pharmacologically active microcarriers PAMs148), desarrolladas y cedidas por el grupo de la Dr. CN Montero-Menei (Centre
Hospitalier Universitaire, Angers, Francia), tienen un diámetro aproximado de 60μm. Están compuestas de ácido poli (D,L-láctico-co-glicólico) (PLGA) y recubiertas con una mezcla de poli-D-lisina (3,5 μg/cm2) y de fibronectina (5 μg/cm2).
Se recibieron del grupo de la Dr. CN Montero-Menei las esferas PAMs liofilizadas y estériles.
Protocolo de sembrado:
- Se tripsinizaron las células a sembrar y se lavaron dos veces en medio sin FBS. - Se añadieron las células a las esferas PAMs, a una concentración de 106 células por
mg de PAMs, en un eppendorf.
- Se colocó el eppendorf en un agitador orbital, a 37º C y a una concentración del 5% de CO2, y se mantuvo a 6 rpm durante dos horas.
- Se centrifugó a 10000 rpm durante 15 segundos para separar las células no unidas a las PAMs.
- Se retiró el sobrenadante y se resuspendió el precipitado con medio suavemente. Se colocaron las PAMs sembradas con una punta de pipeta recortada en pocillos de una placa de 24 para continuar el cultivo.
- Se cambió el medio cada dos o tres días.
4.8. Soporte de quitosano
El material basado en quitosano149,150 utilizado, fue desarrollado y facilitado por el
grupo del Dr. NM Neves (University of Minho, Braga, Portugal). Este material está compuesto por quitosano (obtenido a partir de quitina animal) y por poli(butileno succinato) en una proporción del 50% cada uno. Se caracteriza por tener una porosidad del 80%.
Se recibieron del grupo del Dr. NM Neves matrices de quitosano en forma de cubos y discos esterilizados.
Protocolo de sembrado:
- Se sumergieron las matrices, el día antes de sembrar las células, en 30 ml de medio sin FBS en un falcon de 50 ml y se eliminó el aire generando vacío.
- Se tripsinizaron las células a sembrar y se resuspendieron en medio para obtener una concentración de 25·106 células/ml.
- Se colocaron las matrices en placas no tratadas para el cultivo celular.
- Se depositaron 10-20 μl de la suspensión celular en la superficie de cada matriz. Se pipeteó el volumen de suspensión que difundía a través de la matriz y se volvió a depositar sobre la misma. Se repitió hasta que todo el volumen fue absorbido por la matriz.
- Se colocaron las placas a 37º C y a una concentración del 5% de CO2 durante 1-2
horas.
- Se colocaron las matrices sembradas en pocillos de una placa de 24 y se añadió medio hasta que la matriz quedó totalmente cubierta.
- Se cambió el medio cada 2 o 3 días.