Las fibras de hidroxiapatia obtenidas por el proceso de electrospinning tomando como precursor hueso de puerco, permitirá obtener estructuras con características de porosidad y fibras imiten la regeneración ósea en una fractura inducida en huesos de rata.
Objetivos
• Determinar los parámetros de proceso para la elaboración de fibras de hidroxiapatita a través de electrospinnig.
• Caracterización química, morfológica de compuesto de nanofibras
• Evaluar las características de biocompatibilidad y degradación a través de un fluido corporal simulado y en ratas .
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2. MARCO TEORICO
La última década se ha caracterizado, por la aparición de una nueva clase de materiales basados en especies orgánicas e inorgánicas combinadas en una escala nanométrica los cuales han obtenido atención recientemente. Estos nuevos materiales, denominados nanocompuestos o hibridos organico-inorganico, tienen la posibilidad de convertirse en el nuevo material que tenga lo mejor de los dos mundos, la ventaja de un material orgánico como peso ligero, flexibilidad y buena moldeabilidad y la alta resistencia mecánica, térmica y química de los materiales inorgánicos.
En 2002 Shao et al [91], obtuvieron fibras de polivinil alcohol (PVA)/ sílice por medio de la técnica de electrohilado. En este trabajo se investigaron sus propiedades físicas como morfología, cristalinidad, grado de adherencia entre el material inorgánico y orgánico. La investigación se enmarco dentro de un proyecto factible. Materiales económicos y fáciles de conseguir. Mostrando las condiciones de operación del sistema de electrohilado. Las técnicas utilizadas para caracterizar su composito fueron Microscopia Electrónica de Barrido, Espectro Infrarrojo, Difracción de Rayos X y la Calorimetría Diferencial de Barrido.
La conclusión más relevante de este trabajo es el análisis que hacen sobre la sensibilidad de agua al momento de preparar el composito PVA/silica. Su estudio mostro el grado de solubilidad e hinchazón de cada una de sus muestras preparadas. Determinaron que la solubilidad del PVA disminuye por la adicion del compuesto organico y esta solubilidad disminuyo drásticamente cuando el contenido de sílice se encontraba por encima del 34% en peso de material inorgánico.
Este trabajo se relaciona con la investigación de Shao et al [91], con los parámetros de carga del material inorgánico que en nuestro caso es la hidroxiapatia y el vehiculo utilizado para realizar el electrohilado PVA.
59 En 2006 Jia et al [134] desarrollo fibras de pva con chitosan por el método de electrospining, buscando producir una membrana con nanofibras de PVA/Chitosan donde su aplicación más importante es utilizarlo como soldadura biomédica.
Estudio los efectos de la proporción de volumen del PVA al Chitosan analizando factores como diámetro y morfología de las nanofibras. Asi como la influencia de los parámetros de procesamiento en el aparato de electrospinnig.
En su trabajo realizo una serie de mezclas de PVA con Chitosan (3% al 30% en peso de chitosan) caracterizándolas por las siguientes técnicas: Microscopia Electrónica de barrido (SEM), Transformada de Fourier de Infrarrojo (FTIR), Rayos X (XRD) y Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC).
Sus resultados indicaron que el diámetro medio de la fibra disminuyo gradualmente con el aumento en el contenido de Chitosan del 10% al 30%. Pon encima del 30% de Chitosan en la mezcla, las nanofibras no se podían formar. De acuerdo con la morfologia una concentración menor al 3% en Chitosan solo generó aglomerados, las formación de fibras continuas empezaron a partir de concentraciones del 9%, sin embargo a partir de un 10% de concentración de Chitosan el proceso de electospining fue más difícil por la alta viscosidad de la solución. Los análisis FTIR y XRD demostraron que hay fuertes enlaces de hidrogeno entre el Chitosan y el PVA. La Calorimétria Diferencial de Barrido mostró la microestructura cristalina de la mezcla de PVA/Chitosan no se desarrolló bien en comparación de las fibras que solo tienen PVA. Esto debido a que la mayoría de las cadenas se encuentran en un estado no cristalino debido a la solidificación rápida del material a causa del estiramiento de la solución que produce el electrospining.
La relación de este trabajo con el de Jia [134] nos ayudó a establecer las concentraciones de soluto-solvente (Hidroxiapatita/ PVA). Garantizando la formación de estas en el aparato de electrospining.
Ruksudajrit obtuvo nanohidroxiapatita a partir de hueso de bovino mediante el método de molino de vibración. El hueso de bovino fue desproteinizado con agua caliente se calcino a 800°C durante 3 horas. El producto resultante lo trituro. El material triturado se sometió a diferentes tiempos de molienda (2h, 4h y 8h). Caracterizó los polvos por Difracción de
60 Rayos X, Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM), Microscopia Electrónica de Barrido (SEM) y Dispersión de Rayos X (EDS).
Determino que el método de molienda de vibración fue una ruta muy simple para la síntesis de polvo nanocristalino de HAp a partir de hueso de bovino. Se encontró que el periodo óptimo fue alrededor de 2-4 horas que puede separar y dispersar los cristales de HAp. La aportación de Ruksudajrit en este trabajo fue los rangos de tiempo de residencia para la molienda de alta energía para la reducción de tamaño de partícula la HAp tomando como precursor al hueso de puerco.
Teng et al [135] proponen en el 2008 un método diferente para la producción de fibras de hidroxiapatita tomando como vehículo de transporte al Colágeno. Si se ha informado de que las propiedades de la solución tales como la viscosidad conductividad y la tensión superficial, juegan un papel importante durante el proceso de electrospinnig para materiales poliméricos. Así que Teng et al [135] propusieron que el estado del precursor sea una emulsión, para que sea un factor básicamente significativo para la producción uniforme de nanopartículas llena de fibras de polímero en este caso el Colágeno.
El método convencional, el precursor se presenta en polvo precipitado y secado, se utilizan para mezclar con soluciones de polímero. Sin embargo, durante el proceso en seco, la aglomeración entre las nanopartículas debido a su alta energía superficial, lo que sería desventajoso para la dispersión de partículas en la solución de polímero. En su estudio, propusieron preparar soluciones de compuestos homogéneos, tanto del precursor de HAp, y Colágeno.
Las nanopartículas de HAp fueron preparados por un titulación simultanea de Ca(OH)2 y
H3PO4. Después de mezclado y un proceso de centrifugación y lavado posterior, el gel
precipitado se mezcla directamente con una solución de colágeno, seguido de agitación continua durante 24 horas. El precursor de nanocompuesto resultante se dejó reposar hasta varios días.
Se probaron distintas formulaciones se logró un 30% en peso de HAp, una concentración muy alta con referencia a la literatura reportada entre un 10 y 12% en peso [134].
61 Las soluciones del material compuesto homogéneo fueron sometidas a un proceso de electrospinnig, para formar fibras.
Las fibras preparadas tuvieron un diámetro de 60 nm, y los cristales de nanohidroxiapatia fueron incrustadas en la matriz de colágeno sin ninguna aglomeración. El procedimiento modificado demostró una mayor eficiencia en la preparación de nanofibras inorgánicas uniformes con compuestos orgánicos en comparación al método convencional.
Parte de la aportación de este trabajo que se está presentando, es preparar la materia prima de una manera natural a partir de hueso de puerco. Por lo que hay que considerar lo publicado por Sobczak-Kupiec en 2011 [135]. Estudió el efecto de la temperatura de calcinación y el contenido de CaO libre en la hidroxipatita de origen natural obtenida a partir de huesos de cerdo mediante tres etapas: hidrólisis con aplicación de ácido láctico, pre-calcinación a 600° y calcinación dentro de un rango de temperatura de 750-950°C. La calcinación se llevó a cabo en un horno de cámara estacionaria calentado eléctricamente en atmósfera de aire, en un horno rotatorio a escala de laboratorio equipado con un quemador de gas.
La presencia de CaO en la hidroxiapatita diseñada para aplicaciones médicas no puede ser aceptada. En contacto con moléculas de agua CaO, que se encuentra en la hidroxiapatita se conviere en Ca(OH)2. Eso da a lugar a tensiones y grietas en el material cerámico generando una fuerte alcalinidad en el entorno del implante. Este es problema de la presencia de óxido de calcio en la HAp de origen animal es significativa con respecto a sus aplicaciones como biomaterial. Sobczak-Kupiec et al investigaron el efecto de los parámetros de calcinación en el calcio libre contenido en la hidroxiapatia obtenida a partir de hueso de puerco.
Con este trabajo consideramos primordial calcular el contenido de CaO libre en la producción natural de HAp a partir de fémur de hueso de puerco con técnicas como EDS o DRX al momento de caracterizar nuestra materia prima.
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3.-Metodología Experimental
Preparación de Materia Prima.
Como se mencionó anteriormente en este trabajo utilizamos como precursor de hidroxipatita hueso de puerco, enfocándonos en el fémur de cerdo.
El fémur se hirvió en agua durante 5 horas, a fin de eliminar todos los tejidos suaves, grasa y componentes externos. Limpio y seco el hueso, se sumerge por 24 horas en una solución de H3PO4 17mg/100g . Después 2 horas en la estufa a 250°C. La inmersión en la solución
de H3PO4 y el tratamiento térmico en la estufa permite a la muestra hacerla quebradiza,
para que el hueso sea manipulado en los siguientes procesos
Después el hueso es sometido a un atricionador de baja velocidad donde se obtienen astillas.
Los polvos obtenidos son secados a 250°C por 2.5h y sinterizada a 1050°C por 2.5h. El uso de altas temperaturas nos garantiza un material seguro, idóneo para evitar cualquier tipo de contaminación microbiana, la alta temperatura también ayuda a descomponer y volatizar componentes orgánicos, proporcionando la cristalinidad característica de la HAp. Como lo muestra la siguiente figura 22.
Figura 22.Digrama de flujo para la preparacion de los polvos de Hidroxipatita a partir de femur de puerco.
63 En la figura 23 se puede ver claramente la diferencia en color y textura de astillas de hueso con polvo de hidroxipatita despues a tratamiento térmico.
Figura 23 Imágenes de la materia prima de hueso a hidroxiapatita
Distribucion de Tamaño de Particula
La molienda de alta energía es el proceso que la partícula se fractura en pequeñas partículas sin cambiar su estado de agregación. Además de obtener un tamaño específico de partícula incrementa el área superficial e induce defectos dentro de su red cristalina que favorecen regiones alta actividad [137].
Un tamaño de partícula adecuado permite la homogenización de la HAp dentro de la solución de PVA (polivinil alcohol) y esto permite que la salida de la solución por el orificio de aguja sea manera fluida en el electrospinnig.
Utilizando un molino de alta energía tipo Spex modelo M800. Se trabajó la HAp a diferentes tiempos de residencia (1h, 2h, 3h). Figura 24.
Empleando como medio de molienda 3 bolas de acero inoxidable de 12.66 milímetros de diámetro con un peso de 8.37 gramos, 3 bolas de acero inoxidable de 11.05 milímetros de diámetro con un peso de 5.56 gramos. La carga al contenedor fue de 5 gramos de Hap.
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Figura 24. Molino Alta Energía Spex modelo M8000.
Una vez terminado el tiempo de residencia en el molino de alta energía, la muestra se limpia con una solución al 10% de HCl en agitación constante con el fin de eliminar trazas de fierro provenientes de los medios de molienda. Se filtra con papel filtro y embudo, el lodo se deja secar; obteniendo un polvo de HAp
Siguiendo la metodología descrita en la siguiente figura 25
Figura 25. Diagrama de flujo para el proceso de alta energía de la materia prima HAp a partir de hueso de puerco.
Preparación de la solución de PVA.
El uso de polímeros naturales, se ve con particular interés ya que sus productos de degradación pueden ser incorporados en formas de trayectorias metabólicas normales del
65 huésped evitando efectos secundarios. Al mismo tiempo, los polímeros naturales presentan una excelente adhesión celular, la proliferación y diferenciación. [138]
EL PVA está aprobado para uso en diversas aplicaciones médicas incluyendo parches transdérmicos, la preparación de jaleas que se secan rápidamente cuando se aplica sobre la piel, y en formulaciones de comprimidos de liberación inmediata y sostenida. En soluciones oftálmicas, como lágrimas sintéticas, contienen PVA ya que proporciona una buena dispersión y revestimiento de sus propiedades. [139]
Se utilizó PVA de la marca J.T. Baker 99-99.8% Hidrolizado, con un peso molecular promedio de MW= 77000 – 79000. En la disolución de PVA se debe de tener cuidado de no
formar grumos o una película delgada en la superficie del recipiente. Por ello se utilizó un baño de agua caliente a la temperatura de 85°C bajo agitación constante y se consideró disuelto cuando se obtuvo una solución transparente homogénea.
Se prepararon 60 ml de PVA a diferente porcentaje en peso con agitación constante a una temperatura de 80°C adicionando 1 gramo de HAp.. Figura 26
66 Figura 26. Diagrama de proceso para la preparación de soluciones de PVA y HAp. Se buscó la formación de una emulsión blanca, la cual posteriormente se aplicó en el aparato de electrospining para formar las fibras. Figura 27
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Preparación de fibras Composito de PVA/HAp
El proceso de electrohiladura permite obtener a partir de una emulsion de PVA/HAp, las nanofibras en forma de velo recogido sobre un substrato de hoja de aluminio.
La solución se colocó en una jeringa con una aguja de acero inoxidable de calibre 9. Utilizando el Equipo Nonobond Standar Untit NEU-01 China.
La instalación típica de electrohiladura consta de dos electrodos entre los que se aplica una corriente de alto voltaje. En este caso, el electrodo superior es la aguja donde se encuentra la solución polimerica con hidroxipatita. Por otro lado, el electrodo receptor, cargado con signo contrario, se sitúa en la parte inferior de la máquina y se mantiene en contacto con el substrato colector.
Los controles están disponible en la cara frontal del equipo, mientras que la unidad de alto voltaje está situada en el interior de la máquina figura 28. Por último destacar que la cabina de electrohiladura está sellada durante la marcha del equipo, y en ella se genera una corriente de aire que mantiene la ventilación apropiada.
La estructura principal del equipo se distingue 3 partes bien diferenciadas:
Área de electrohiladura. Se compone de la cabina en la parte intermedia del equipo, donde tiene lugar el proceso de electrohiladura y la formación sobre substrato del velo de nanofibras.
Área de alimentación. Situada al costado derecho del equipo, se encuentran las jeringas de alimentación de las soluciones poliméricas.
Parte Inferior se ubica el panel de mando exterior para el control de todos los parámetros del proceso (velocidades, voltaje intensidad…), además del cableado e instalación eléctrica interior.
68 Figura 28. Fotografías del equipo de electrohiladura Nonobond Standar Untit NEU-01 China a) Vista del panel de Control, b) Substrato Colector, c) Sistema de alimentación
de sustancias poliméricas, d) Otra perspectiva del sustrato colector.
El equipo dispone además de un sistema de descarga de electricidad de la cabina de electrohiladura, la cual queda cargada de electricidad residual al terminar cada proceso. El voltaje aplicado y la distancia entre la punta de aguja y el colector fueron 20KV y 15 cm respectivamente. La velocidad de alimentación de la solución de HAp fue de 0.3 ml/hora.
Para conseguir el electrohilado de los velos de nanofibras se sigue el procedimiento adjunto:
1.- Se prepara el substrato, la hoja de aluminio se debe de encontrar perfectamente extendida.
2.- Se controlan las condiciones ambientales dentro de la cabina de electrohiladura. 3.-Se fijan las condiciones de alimentación de la solución polimérica.
69 5.- Una vez terminado el proceso de electrohilado se checa por seguridad que todo el equipo este descargado.
Condiciones de operación para el proceso de electrohilado. Parámetros
Voltaje 20 KV
Distancia aguja-colector 15 cm
Velocidad de flujo. 0.3 ml/hora
Tabla 1 Condiciones de operación del equipo de Electrohiladura.
Después de un tiempo de residencia de 30 minutos se obtienen un velo abundante de nanofibras que se observan a simple vista, su textura es suave y se deshacen al tacto. Figura 29.
70 El diagrama de flujo muestra las técnicas de caracterización a las que se van a someter los velos de PVA/HAp. Figura 30.
Figura 30 Diagrama de Proceso para elaboración de fibras de PVA/HAp.
Una vez de tener los velos de nanofibras se prepara la siguiente fase de pruebas biológicas y evaluar la regeneración de hueso de rata.
Pruebas Biológicas.
Animales de Experimentación. Fueron seleccionadas 10 ratas Wistar (Rattus norvergicus albinus) cuyo peso varió entre 180 y 200 gramos, las cuales fueron desparasitadas y alojadas en una jaula durante 15 días, antes de la intervención quirúrgica con el propósito de que se adaptaran.
Condiciones de Estabulación. La cirugía, mantenimiento y sacrificio de los animales se realizó en el laboratorio de materiales en la Facultad de Odontología de la Universidad Autónoma de Chihuahua, según los requisitos éticos y legales vigentes.
Las ratas fueron mantenidas en 2 jaulas cada quien según el grupo de estudio al que pertenecían. Todas las ratas fueron mantenidas en las condiciones ambientales regladas para estabulación de animales de laboratorio: 12 horas de luz y 12 de oscuridad, 20-24°C de rango de temperatura y un grado de humedad relativa en el rango de 55±10%.
71 Normativas éticas y de bienestar. Todas las ratas utilizadas en el estudio recibieron un trato digno, de acuerdo a la norma mexicana NOM-062-ZOO-1999.
Comité ético de bienestar animal. El estudio se obtuvo el permiso necesario para la experimentación animal en el comité de experimentación bioética animal de la Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de Chihuahua.
Ensayos In Vivo
Protocolo anestésico: para la intervención, cada rata fue anestesiada con una solución de ketanina (Ketolar, 125mg/kg), diazepam (Valium, 10 mg/kg), y atropina (o.05 mg/Kg) administrada por vía intrapertoneal. (0.5 ml de solución con 2 mg de ketamina). En caso de precisar más tiempo quirúrgico se administran inyecciones de 0.1 ml de la misma solución. Figura 31.
Figura 31. Protocolo anestésico
Protocolo analgésico. Tras la intervención cada individuo recibió una dosis profiláctica de analgésicos y antibióticos: 5 mg de enroflaxicna (Baytril, 5-10 mg/kg) en dosis única por via subcutánea.
Protocolo de cuidados posoperatorios. Se reintrodujo la dieta líquida a las 4 horas y sólida pasadas 12 horas tras la cirugía. Durante la primera hora posoperatoria el espécimen
72 permaneció en una jaula asilada. Una vez recuperada y comprobando la estabilidad de sus funciones vitales, la rata se introdujo con las otras de su mismo grupo. Figura 32.
Figura 32. Protocolo de cuidados posoperatorios. Protocolo quirúrgico
Colocación del Xenoinjerto (Composito de PVA y Hap, nanofibras) induciendo fractura.
Con la rata en decúbito lateral se procede al rasurado y limpieza de la zona a operar. Se realiza un abordaje sobre la cara lateral de la pata de la rata. El abordaje de los planos musculares se realiza a través de las fascias sin necesidad de realizar ninguna sección muscular que haría especialmente dolorosa la recuperación del animal. Se realiza una osteotomía con una fractura continua diafisaria a unos 10 mm de la interlinea articular. Para reproducir las condiciones fisiológicas de la fractura, esta se realizó mediante sierra de Gillies, dejando como patrón de fractura una oblicua larga con mínima conminución. Se introduce el material composito de nanofibras de PVA y HAp en la fractura inducida. Posteriormente se procede al lavado de la superficie ósea con suero fisiológico y cierre por plano de las heridas quirúrgicas, con material reabsorbible (Vicryl 3/0 para el plano