horas desde su siembra.

Tras 12 horas desde que fueron sembradas las células, las BOECs control habían formado una red de tubos similar a la formada por las HUVECs. Sin embargo, las células HHT1 no fueron capaces de formar tubos. Las HHT2n formaron una red de forma similar a las células control, pero, sin embargo, esta red estaba formada por tubos más finos y frágiles. Las HHT2m tampoco fueron capaces de formar tubos, sino que se agrupaban formando aglomerados de células de los cuales surgían pequeños brotes de vasos, que no llegaba a extenderse. Existen, como vemos, claros defectos

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

160

en angiogénesis que sin embargo se manifiestan de forma distinta en cada tipo de célula.

Como otra prueba relacionada con angiogénesis decidimos analizar por ELISA los niveles de Ang-2, y también como una manera de validar el

Microarray midiendo los niveles de proteína de forma alternativa al Western Blot. Elegimos la Ang-2 además de por su clara implicación en angiogénesis,

porque se trata de un factor soluble que de encontrarse en niveles reducidos en el plasma de pacientes, podría emplearse como un criterio diagnóstico muy sencillo de medir. Así, a partir de muestras de plasma de 26 pacientes de HHT, HHT1 y HHT2 indistintamente, y 10 controles sanos, así como de ratones silvestres eng+/+ _{y heterocigotos eng}+/-_{, se midieron los} niveles de Ang-2 circulante (Figura 60).

Figura 60. Niveles de Angiopoyetina-2 en plasma. A. Muestras de 26

pacientes de HHT y 10 controles sanos. B. Muestras de ratones silvestres eng+/+ _{(wt) y heterocigotos eng}+/-_.

Tanto en el caso de los pacientes de HHT como en el de los ratones heterocigotos para endoglina, encontramos unos niveles de ~50% con respecto a los controles. La concentración de Ang-2 que obtuvimos en el caso de las muestras control se encontraba dentro de los márgenes de normalidad según el fabricante del kit de ELISA (1071-4389pg/ml),

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

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mientras que las muestras de HHT se encontraban debajo de estos límites, lo que indicaba que el experimento era reflejo de la realidad y que puede ser empleado como un método de diagnóstico rápido. Existen trabajos que muestran alteraciones en los niveles de otra molécula proangiogénica, el VEGF, en plasma de pacientes de HHT. Sin embargo, los datos al respecto son escasos y contradictorios (Cirulli et al., 2003; Sadick et al., 2005a; Sadick et al., 2005b). Hasta la fecha nada se había publicado con respecto a los niveles de Ang-2 en pacientes de HHT.

El descenso de Ang-2 que encontramos es muy significativo y puede ser responsable de importantes alteraciones en el proceso de angiogénesis, lo que llevaría a una deficiente reparación cuando se producen roturas de capilares o de las propias fístulas que se forman frecuentemente en estos pacientes.

4.5 Estudio de la migración de células endoteliales de

pacientes de HHT

Ensayamos también la capacidad de migración de las BOECs HHT, y lo hicimos mediante un ensayo de “cicatrización” in vitro o wound healing. Sembramos las células de los pacientes y las células control e hicimos una raya o herida que recorría el pocillo de extremo a extremo. A continuación, tomamos fotos cada 4 horas estudiando el tiempo que tardaban las células en invadir y cerrar la herida (Figura 61).

Las células control cierran la herida antes de las 18 horas, mientras que las células HHT1 y HHT2n no lo logran hasta pasadas 24h. Las HHT2m, pese a ser las primeras que comienzan a migrar, lo hacen de forma desordenada y a las 24 horas aún no han logrado cicatrizar. Sería interesante, en un futuro próximo, completar este experimento con un ensayo de migración de células endoteliales en cámaras Transwell, en las cuales las células migran en respuesta a un gradiente de quimioquinas.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

162

Figura 61. Ensayo de wound healing con BOECs HHT y BOECs control. Se tomaron fotografías a las 0, 12, 18 y 24 horas. Los asteriscos

rojos representan el momento en el que la herida se encontraba cerrada.

18 h

24 h

12 h

0 h

Control

HHT1

HHT2n

HHT2m

18 h

24 h

12 h

0 h

Control

HHT1

HHT2n

HHT2m

*

*

*

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

163

Encontramos defectos en migración en las células procedentes de pacientes, lo cual concuerda con el hecho de que estas células tengan alterada la vía de señalización ALK1/Endoglina. Estos defectos en migración pueden en parte ser causa de que no se lleve a cabo un proceso de angiogénesis adecuado.

4.6 Estudio de la adhesión de células endoteliales de

pacientes de HHT

Estudiando los genes diferencialmente expresados en el Microarray, comprobamos que un gran número de ellos codificaban proteínas implicadas en adhesión, tanto entre células endoteliales como célula endotelial- leucocito o célula endotelial-lámina basal (Figura 62). De entre estas proteínas podríamos destacar:

- ESAM (Endothelial Cell-Selective Adhesion Molecule) y VE- Cadherina 2: ambas están implicadas en adhesión entre células endoteliales mediante interacciones homotípicas. ESAM se encuentra en uniones estrechas entre células (Nasdala et al., 2002) y también se ha descrito que participa en extravasación de neutrófilos y regulación de la permeabilidad vascular (Wegmann et al., 2006). VE-Cad 2 se encuentra en uniones adherentes entre células endoteliales adyacentes (Cavallaro et al., 2006) y mediante su interacción con beta-catenina parece que puede regular el citoesqueleto de actina (Chiu et al., 2004).

- PECAM-1 y JAM-A (Junctional Adhesion Molecule-A): Ambas proteínas pertenecen a la superfamilia de las Inmunoglobulinas, se expresan tanto en células endoteliales como leucocitos y están implicadas directamente en el paso de éstos a través de la barrera endotelial (Nourshargh et al., 2006). PECAM-1 regula la migración transendotelial mediante interacciones homotípicas, mientras que JAM-A parece que puede formar tanto interacciones homotípicas como heterotípicas con la integrina LFA-1 (Lymphocyte Function-Associated Antigen-1) (Muller, 2003).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

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- ITGA6 (Integrina α6): Integrina implicada directamente en la adhesión a laminina, proteína fundamental, junto con el colágeno tipo IV, de la lámina basal perivascular (Wang et al., 2005).

Figura 62. Moléculas implicadas en la adhesión de células endoteliales cuyos genes estaban diferencialmente expresados en el Microarray. Se

muestran procesos de adhesión CE- CE, CE-leucocito y CE-lámina basal.

Hicimos un ensayo de adhesión a sustrato con BOECs HHT y BOECs control, empleando como sustrato fibronectina. Dejamos adherir las células al sustrato y tras una hora lavamos y teñimos con cristal violeta. Mediante un ensayo colorimétrico calculamos el número de células que habían permanecido adheridas, comparando con las BOECs control (Figura 63).

Figura 63. Ensayo de adhesión a fibronectina empleando BOECs HHT y BOECs control. Se muestra el número de células que permanecieron

adheridas al sustrato tras una hora de adhesión. En todos los casos se emplearon triplicados. Se muestra un experimento representativo.

PECAM-1