Identificación de la lisina ubiquitilada en Mcwc-1b

Trabajos previos de nuestro grupo de investigación demostraron que la proteína Mcwc-1b es ubiquitilada y que esta modificación bloquea la actividad de la proteína, aunque no provoca su degradación (Silva et al., 2008). Así, en análisis tipo Western-blot, utilizando anticuerpos específicos contra esta proteína, se detectan tres formas de la misma. La forma con la mayor movilidad electroforética, que tiene un tamaño estimado de 106 kDa, corresponde a la forma no ubiquitilada, mientras que las dos formas de 115 kDa y 125 kDa corresponden a la proteína con una y dos moléculas de ubiquitina unidas, respectivamente. La presencia de moléculas de ubiquitina en las formas de mayor tamaño se demostró de forma indirecta mediante la utilización de anticuerpos policlonales contra la ubiquitina humana, pero esta aproximación experimental no permite conocer la lisina o lisinas que son ubiquitiladas. La caracterización del punto concreto de ubiquitilación es imprescindible para conocer la base molecular del bloqueo de la actividad de Mcwc-1b por ubiquitilación. Por tanto, se siguieron estrategias bioquímicas (análisis de péptidos mediante espectrometría de masas) y genéticas (mutagénesis dirigida) para la identificación de la lisina modificada por ubiquitilación.

3.1.1. Detección de ubiquitina por espectrometría de masa.

Los sitios de ubiquitilación pueden conocerse mediante la identificación de los péptidos de la proteína que presentan una masa molecular alterada como consecuencia de la unión de la molécula de ubiquitina. En este caso particular, la estrategia se basó en la purificación de las tres formas de la proteína Mcwc-1b, para su posterior digestión con Tripsina, separación de los péptidos producidos mediante cromatografía líquida de alta resolución y análisis de los mismos mediante espectrometría de masas (HPLC-MS). La comparación de las masas de los péptidos obtenidos a partir de las tres formas de la proteína Mcwc-1b debería identificar los péptidos provenientes de las formas ubiquitiladas que modifican su masa con respecto a los provenientes de la forma sin ubiquitilar. Estos péptidos deberían incluir la lisina o lisinas que son dianas de la ubiquitilación.

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3.1.2. Purificación de Mcwc-1b.

La purificación de Mcwc-1b se realizó mediante inmunoprecipitación a partir de extractos totales de proteína. Concretamente, se obtuvieron extractos de proteínas de la estirpe silvestre (MU241), de un mutante nulo para crgA (MU221) (Navarro et al., 2001) y de un mutante nulo para mcwc-1b (MU244) (Silva et al., 2006). Las formas de Mcwc-1b presentes en los tres extractos se inmunoprecipitaron usando anticuerpos monoespecíficos generados contra parte de la proteína (Silva et al., 2008). Para comprobar el éxito en la inmunoprecipitación, una alícuota de cada uno de los los inmunoprecipitados se analizó mediante Western-blot, utilizando los mismos anticuerpos usados en la inmunoprecipitación. Tal como se había descrito previamente (Silva et al., 2008), en la estirpe silvestre se observó las tres formas de la proteína Mcwc-1b, mientras que en la estirpe nula para crgA se observó solo la forma sin ubiquitilar y en la estirpe nula para mcwc-1b no se observó ninguna forma. El resto de los inmunoprecipitados se sometió a electroforesis en un gel preparativo SDS-PAGE. La tinción del gel con una tinción de plata (véase Materiales y Métodos) que permitía el análisis posterior de las proteínas, reveló la existencia de tres bandas específicas correspondientes a las formas de la proteína Mcwc-1b presentes en la estirpe silvestre (Figura 14) una de las cuales, la de menor tamaño, coincidía con la única que aparecía en la estirpe mutante para crgA. Por tanto, las tres bandas específicas de la estirpe silvestre se recortaron del gel para su posterior análisis.

77 3.1.3. Análisis mediante espectrometría de masas de las proteínas purificadas.

Las bandas aisladas se destiñeron y las proteínas contenidas se sometieron a una digestión con Tripsina. Las proteínas sometidas a la digestión no se extraen previamente de la acrilamida, sino que los péptidos resultantes de la digestión son los que se liberan y se recogen. Los péptidos obtenidos de cada muestra se analizaron mediante HPLC conectado a una trampa de iones. De esta forma, se identificó la masa molecular de los péptidos presentes en cada muestra. Los datos obtenidos de cada muestra se compararon con la base de proteínas de Mucor para identificar los péptidos presentes en cada muestra, así como de las proteínas de las que derivan.

Péptidos derivados de la proteína Mcwc-1b se observaron en las tres bandas analizadas, mientras que la ubiquitina solo aparece en las 2 bandas de mayor tamaño (Tabla 5 y Figura 15). Estos resultados, por un lado, confirman que las proteínas purificadas correspondían a formas de Mcwc-1b y, por otro lado, sugieren que las formas de mayor

Figura 14. Proteínas inmunoprecipitadas utilizando el anticuerpo contra Mcwc-1b. Las proteínas inmunoprecipitadas por el anticuerpo contra Mcwc-1b, a partir de extractos totales de las estirpes indicadas en cada calle, se sometieron a electroforesis en un gel SDS-PAGE del 7%. Tras la electroforesis las proteínas se tiñeron con plata mediante el kit ProteoSilverTM Silver Stain Kit (SIGMA). La flecha roja marca la banda

correspondiente a la forma de 106 kDa no ubiquitilada, mientras que la naranja y verde marcan las formas ubiquitiladas de 115 kDa y 125 kDa, respectivamente. M: marcador de tamaño.

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tamaño están ubiquitiladas, tal como se había deducido de los experimentos de Western utilizando anticuerpos contra la ubiquitina humana (Silva et al., 2008). No obstante, la baja concentración de proteína de Mcwc-1b hizo imposible tener una información exhaustiva de los péptidos generados a partir de cada una de las formas de la proteína, que era necesaria para localizar la lisina ubiquitilada. Tras varios intentos, los resultados no mejoraron y se descartó esta estrategia para localizar la lisina o lisinas ubiquitiladas en la proteína Mcwc- 1b. Por otro lado, esta aproximación experimental permitió identificar el gen de Mucor, de los 10 que existen en su genoma que podrían cifrar la molécula de ubiquitina, que cifra la ubiquitina que se une a Mcwc-1b, ya que los dos péptidos detectados solo aparecen en la proteína con ID 157563. No obstante, los datos disponibles no permiten determinar si esta molécula de ubiquitina concreta es la única que se une a Mcwc-1b.

1B

Base de

Datos Proteína Grupo Péptidos Score

Peso Molecular

cobertura

% Especie

WC1B WC1B 1 3 21.29 88187.7 6 Mucor circinelloides

z Score MH+ SPI (%) Secuencia

2 8.53 1900,321 90.5 (R)TSNPIPGMEDHEFWGK(L) 2 7.66 1499,101 85.6 (K)AICHPSDITTVMR(E) 3 5.10 2613,241 70.1 (R)KNSGYMWIECSGKLRNE DGRGR(K)

1B-monoubiquitinada

Datos Proteína Grupo Péptidos Score

Peso Molecular

covertura

% Especie

WC1B WC1B 1 2 11.06 88187.7 4 Mucor circinelloides

z Score MH+ SPI (%) Secuencia

2 7.21 1499,101 84.3 (K)AICHPSDITTVMR(E) 3 3.85 2613,241 60.3 (R)KNSGYMWIECSGKLRNE

DGRGR(K)

Base de

Datos Proteína Grupo Péptidos Score

Peso Molecular

covertura

% Especie

Ubiq Ubiquitina 2 1 3.60 8583.8 17 Mucor circinelloides

z Score MH+ SPI (%) Secuencia

2 3.60 1523,781 75.6 (K)IQDKEGIPPDQQR(L)

1B-diubiquitinada

79 Base de

Datos Proteína Grupo Péptidos Score

Peso Molecular

covertura

% Especie

WC1B WC1B 2 1 3.20 88187.7 2 Mucor circinelloides

z Score MH+ SPI (%) Secuencia

3 3.20 2613,241 50.4 (R)KNSGYMWIECSGKLRNE DGRGR(K)

Base de

Datos Proteína Grupo Péptidos Score

Peso Molecular

covertura

% Especie

Ubiq Ubiquitina 1 2 8.52 8583.8 38 Mucor circinelloides

z Score MH+ SPI (%) Secuencia

2 4.85 1763,985 78.4 (K)TITLEVESSDSIENVK(Q) 2 3.67 1523,781 77.3 (K)IQDKEGIPPDQQR(L)

A

B