Identificación de los genes v-Flip y v-Bcl

Se amplificaronambos genes en las cepas 09/508 (genotipo 1), 12/365 (genotipo 2) y las cepas 09/227 y 07/435 (genotipo 3). No fue posible amplificar ninguno de los dos genes en las cepas 08/263 y 08/330 (genotipo 2) (Figuras 30 y 31).

Figura 30. Amplificación del gen v-Bcl2 en las cepas argentinas de BoHV-4.

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El alineamiento de la secuencia del v-Bcl2 de las cuatro cepas locales de BoHV-4 con las cepas Movar, Q9WH78, LRV140 (tipo europeo) y DN599 (tipo americano), reveló que el v-Bcl2 de las cepas 09/227 y 07/435 (genotipo 3) presentan 13 sitios variables, con sustituciones sinónimas y no sinónimas localizadas en las posiciones 240, 273, 284, 305, 345, 360, 369, 372, 381, 423, 456, 552 y 555; mientras que en las cepas 09/508 (genotipo 1) y 12/365 (genotipo 2) se identificaron tres sustituciones en los sitios 357, 360 y 453 (Figura 32).

En las cepas 09/227 y 07/435 también se detectaron dos sustituciones aminoácidicas en la proteína v-Bcl2: R95K y S202N (Figura 33). La sustitución R95K se localiza en uno de los sitios de reconocimiento de las caspasas dentro del dominio de homología BH3 (Bellows et al., 2000). Ambas sustituciones corresponden a aminoácidos pertenecientes a grupos homólogos; (R95K, polares básicos y S202N, polares neutros). En los dominios de homología BH1 y BH2 no se evidenciaron sustituciones. El BH4 y el dominio de transmembrana (TM) no quedaron incluidos en la secuencia determinada de las cuatro cepas locales.

En el alineamiento del gen v-Flip de estas cuatro cepas, contrastado con las cepas LVR140, Movar, S108 (tipo europeo) y Buf, se detectaron 15 sustituciones, sinónimas y no sinónimas, para las cepas 09/227 y 07/435; 14 de esas sustituciones localizadas en las posiciones 199, 235, 241, 244, 280, 281, 296, 301, 310, 341, 395, 417, 433 y 444 para ambas cepas, y en 191 para la cepa 09/227 y en 464 para la cepa 07/435.

En la secuencia de la cepa 09/508 se hallaron 12 sustituciones localizadas en 133, 135, 136, 163, 280, 301, 310, 337, 368, 395, 444 y 514. La cepa 12/365 presentó una menor cantidad de sustituciones (8), en las posiciones 280, 301, 310, 337, 368, 395, 444 y 514 (Figura 34).

La proteína v-Flip presentó siete sustituciones aminoacídicas en las cepas 09/227 y 07/435; seis de ellas en los mismos sitios para ambas cepas: K36E, R52I, R70K, H83Q, T85I y K90T; en la cepa 07/435 se sustituyó P29Q y en la cepa 09/227 N120S. Sólo dos de las sustituciones corresponden a aminoácidos de igual polaridad, (R70K, polares básicos y N120S, polares neutros). En las cepas 09/508 y 12/365 se produjeron cinco sustituciones en las mismas posiciones para las dos cepas: K36E, R52I, Y61C, H83Q y K90N. Además, en la cepa 09/508 se detectaron dos aminoácidos no especificados (I122X y W135X) (Figura 35).

Figura 32. Alineamiento de la secuencia de nucleótidos de un fragmento de 416 pb del gen v- Bcl2 de cuatro aislamientos locales de BoHV-4. La línea de puntos indica nucleótidos idénticos.

Figura 33. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la proteína v-Bcl2 de cuatro aislamientos locales de BoHV-4. La línea de puntos indica residuos idénticos. BH1 , BH2 ,

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Figura 34. Alineamiento de la secuencia de nucleótidos de un fragmento de 437 bp del gen v- Flip de cuatro aislamientos locales de BoHV-4. La línea de puntos indica nucléotidos idénticos.

Figura 35. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la proteína v-Flip de cuatro aislamientos locales de BoHV-4. La línea de puntos indica residuos idénticos.

Discusión

La apoptosis es el mecanismo mediante el cual las células desarrollan un proceso de autodestrucción sistemática como respuesta a una variedad de estímulos, entre los que se pueden considerar las infecciones producidas por virus. En la mayoría de las infecciones virales, el sistema inmune del hospedador induce la apoptosis para la eliminación del virus; en las infecciones virales agudas se produce un aumento de linfocitos T específicos, resultando en apoptosis de la célula infectada con el objetivo de limitar la producción viral y reducir, o anular, la diseminación de la progenie viral en el organismo infectado (Clarke y Tyler, 2009).

Sin embargo, los virus durante su evolución también se han adaptado para utilizar los procesos celulares en función de obtener ciertas ventajas como podría ocurrir, precisamente, con aquellos que poseen la capacidad de inducir apoptosis durante los últimos estadios de la infección; este proceso resulta vital para evadir la respuesta inmune del hospedador durante la diseminación de la progenie viral hacia células vecinas. Durante el proceso de apoptosis, los cuerpos apoptóticos pueden constituir compartimentos útiles para la replicación viral, o bien pueden facilitar una protección para la salida y diseminación viral cuando estas estructuras son fagocitadas por células inmunológicas (Shen y Shenk, 1995; O´Brien, 1998; Clarke y Tyler, 2009). Por el contrario, muchos virus durante su proceso evolutivo han desarrollado la capacidad de evadir o detener el proceso apoptótico mediante la producción de proteínas antiapoptóticas que les permitan completar su ciclo de replicación antes de la destrucción de la célula (Shen y Shenk, 1995; Teodoro y Branton, 1997; Cuconati y White, 2002).

A los efectos de estudiar si los aislamientos locales de BoHV-4 analizados en este trabajo presentan capacidad de inducir apoptosis, inicialmente se realizó un ensayo para determinar si se producen cambios en la morfología nuclear en las líneas celulares utilizadas, que podrían sugerir apoptosis temprana. Luego de la tinción con DAPI, los cambios en la morfología nuclear fueron claramente visibles en las cuatro líneas celulares infectadas con las seis cepas de BoHV-4. Estos cambios, núcleos colapsados, condensación y fragmentación de la cromatina y presencia de cuerpos apoptóticos, fueron consistentes con los reportados en la bibliografía (Maruyama et al., 2000).

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podrían sugerir muerte celular por apoptosis. Esto no fue marcadamente evidente en las tres líneas celulares restantes excepto para la cepa 08/330 en células HeLa. Por otro lado, comparando los valores de IRA de los controles negativos con los controles positivos se observaron diferencias significativas entre los cultivos y los diferentes tiempos de infección solamente en las células Vero y en el control positivo de HeLa a las 48 hpi, por lo que se podría inferir que o bien la metodología utilizada para inducir apoptosis en el control positivo no resultó completamente efectiva, o que el efecto del deoxinivalenol también sería dependiente del tipo celular.

Como se mencionó previamente, la tinción con DAPI es un indicador de cambios morfológicos nucleares en la etapa temprana del proceso de apoptosis; por lo tanto, como se observó a las 24 hpi, los resultados indicarían que al menos a este tiempo de infección las cepas de BoHV-4 analizadas no inducen significativamente el proceso de apoptosis.

Algunos autores mencionan que los cambios morfológicos, no siempre son indicadores seguros de muerte celular por apoptosis y pueden variar entre diferentes líneas celulares (McGahon et al., 1995), por lo que recomiendan que el análisis de este parámetro se complemente con otra metodología, como el estudio de fragmentación del ADN. Consecuentemente se procedió a determinar, mediante electroforesis en geles de agarosa, si se produjo la fragmentación del ADN en cultivos infectados. Aunque este ensayo se realizó sólo con las líneas celulares MDBK y HeLa, se observó (débilmente) la presencia de bandas indicativas de fragmentación en las muestras de células HeLa inoculadas con las cepas 09/508 y 08/330 a las 24 hpi y en el control positivo de las células MDBK a las 48 hpi.

Si bien la degradación del ADN, como resultado de los cortes en sitios internucleosomales, produciendo una "escalera" de fragmentos de ADN detectable por electroforesis en geles de agarosa, es una característica bioquímica de la apoptosis (Compton, 1992), y que la presencia de oligonucleosomas permite distinguir la muerte celular por apoptosis de aquella producida por necrosis (Herrmann et al., 1994), algunos autores (Ioannou y Chen, 1996) consideran que aunque esta técnica es más económica que otras, es laboriosa y provee sólo una apreciación cualitativa de la apoptosis. Los estudios de fragmentación del ADN en geles, generalmente detectan los fragmentos de ADN presentes en un pequeño porcentaje de células en sistemas de cultivos celulares. Por lo tanto, si bien la presencia de la "escalera" de fragmentos implica un proceso apoptótico, su ausencia no lo descarta (Collins et al., 1997).

Para profundizar el estudio sobre la capacidad de estos aislamientos locales de BoHV-4 para inducir apoptosis se realizó un análisis de fragmentación del ADN mediante la técnica de TUNEL, comparando los IRAs de las seis cepas en las dos líneas celulares. De acuerdo con lo descripto por Saraste (1999), la especificidad de los resultados de apoptosis se sustenta cuando se combinan la fragmentación del ADN en geles y las características morfológicas con el método de TUNEL.

Los cambios en la morfología nuclear pueden iniciarse a partir de los 30 minutos a 4 h del estímulo apoptótico, y preceden a los cambios en el citoesqueleto; en cambio la fragmentación del ADN es tardía (26 hpi), por lo que la tinción con TUNEL es un indicador significativo que se puede observar tardíamente durante el proceso de apoptosis (Mesner et al., 1995; Maruyama et al., 2000; Daniel y De Coster, 2004); por lo tanto las técnicas de DAPI y TUNEL en forma complementaria pueden ser utilizadas como indicadores de procesos de daño celular temprano y tardío.

Comparando los resultados obtenidos en ambas líneas celulares se observa una marcada disparidad entre la línea celular MDBK y HeLa. Si bien se menciona que la técnica de TUNEL indicaría apoptosis tardía, en los resultados obtenidos en este trabajo se observó que los valores más altos de IRA se obtuvieron en los cultivos de MDBK a las 24 hpi, lo cual coincide con los resultados obtenidos mediante la tinción con DAPI. Posiblemente la disminución en los valores de IRA a las 48 hpi en esta línea celular sea consecuencia de una pérdida de células durante el ensayo, considerando que en los cultivos de MDBK se detectó la mayor cantidad de células con alteraciones nucleares y precisamente en esta línea se observó que la mayoría de las cepas presentaron ECP a partir de las 24 hpi (Sección I- punto 9); por ello, la presencia de mayor cantidad de células afectadas podría ser un factor predisponente para el desprendimiento de la monocapa, asociado al efecto mecánico de la cantidad de lavados durante el procesamiento por la técnica de TUNEL, efecto que ha sido observado por otros autores (Lombardo et at., 2010).

Clarke y Tyler (2009) mencionan que el aumento de los títulos virales se correlaciona con una mayor proporción de oligonucleosomas en la detección de fragmentación del ADN. Este concepto es coincidente con la fragmentación del ADN por electroforesis en geles de agarosa observada para la cepa 08/330 en células HeLa (a las 24 hpi), considerando que esta cepa se diferenció claramente de las restantes por los elevados títulos virales alcanzados en el ensayo in

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para esta cepa mediante la técnica de TUNEL. Posiblemente estos resultados se deban a que esta técnica detecta estadios más avanzados de apoptosis, cuando la cuantificación de células estaría disminuida por el desprendimiento de la monocapa como consecuencia de la apoptosis (Lombardo et al., 2010). Además, la técnica de TUNEL puede dar resultados falsos positivos debido a la tinción de células que han presentado fragmentación no apoptótica del ADN; por lo tanto, está técnica por sí sola no es un indicador de apoptosis totalmente eficaz (Daniel y Coster, 2004).

Al analizar los resultados obtenidos mediante TUNEL, se observó nuevamente que la línea celular MDBK evidenció IRAs similares al control positivo para las cepas 08/263 y 07/435 a las 24 hpi, y mayores que dicho control para 08/263 y 09/227 a las 48 hpi. La obtención de resultados positivos por esta técnica, sin la detección de los oligonucleosomas mediante electroforesis en geles de agarosa, puede deberse a la escisión del ADN en fragmentos mayores de 50 kb, que no son determinados por la técnica estándar (Mesner etal., 1995).

Como ya se comentó, el registro de los resultados no se pudo realizar con las seis cepas debido a la pérdida de las monocapas celulares, lo que junto con los resultados de cinética de replicación viral confirmaría la mayor susceptibilidad de las células MDBK a la infección por BoHV-4. En las células HeLa los resultados obtenidos a las 48 hpi indicarían que a este tiempo posinfección se presenta efecto compatible con apoptosis para las cepas 08/263, 12/365 y 07/435. Estos resultados difieren de los reportados por Gillet et al. (2004). Según estos autores, si bien las células HeLa son susceptibles a la infección por BoHV-4 la infección no permisiva de estas células las protegería de la apoptosis inducida por TNFα. Cabe recordar que en los experimentos de cinética de la replicación viral, los resultados demuestran que la línea celular Hela evidenció claramente ser permisiva a la infección por los aislamientos locales del BoHV-4.

Varios herpesvirus codifican proteínas con funciones antiapoptóticas como los homólogos de v-Bcl2 (Cuconati y White, 2002) y v-Flip. La familia de proteínas Bcl2 fue caracterizada inicialmente por su actividad sobre el control de la integridad de la membrana mitocondrial externa y sobre la apoptosis. Actualmente se sabe que las funciones de esta familia de proteínas están relacionadas a numerosas vías metabólicas celulares (Chipuk et al., 2010), y dada la amplitud de sus funciones representan un importante punto de equilibrio en la vía de la apoptosis, ya que la muerte celular en muchos casos depende del balance entre los miembros de

esta familia que pueden inhibir o promover la apoptosis (Clarke y Tyler, 2009; Moldoveanu et al., 2014), ya sea por la formación de homodímeros o por la dimerización con otras proteínas celulares (Guillet y Brun, 1996).

El v-Bcl2 es importante en la biología de los gammaherpesvirus; prácticamente todos los virus de esta subfamilia codifican una proteína tipo Bcl2 (Bellows et al., 2000; Cuconati y White, 2002), la que les permite manipular distintos aspectos de la función celular (Gangappa et al., 2002).

Se ha demostrado que algunos virus pueden actuar sobre la expresión de v-Bcl2 para establecer infecciones persistentes (Xu et al., 2012). Del mismo modo, Gangappa et al. (2002) demostraron que la función del v-Bcl2 expresado por el Gammaherpesvirus murino 68 es necesaria para la infección persistente y para una eficiente reactivación de la infección latente, aunque no sería esencial en la infección aguda. Durante la reactivación, el v-Bcl2 prevendría la apoptosis inducida por otras proteínas virales o celulares proapoptóticas.

Los homólogos v-Flips (proteínas virales inhibitorias de FLICE), evitan la activación de la caspasa 8 y contienen dominios efectores de muerte que interactúan con la proteína FADD evitando el reclutamiento y la activación de FLICE (ICE tipo FADD). Estos miembros de la familia v-Flip son codificados por gammaherpesvirus bovinos, equinos y humanos, y las células que expresan estas proteínas están protegidas de la apoptosis inducida por la activación de Fas o de otros receptores de muerte relacionados (O´Brien, 1998).

El BoHV-4 posee, precisamente, dos genes (ORF16 [BORFB2] y ORF71 [BORFE2]) que codifican las proteínas v-Bcl2 y v-Flip, respectivamente (Wang et al., 1997; Zimmerman et al., 2001). Esta característica del BoHV-4 hace que adquiera relevancia para su estudio en relación a la inducción o inhibición de la apoptosis en las células infectadas, considerando que también posee la capacidad de infectar células del sistema inmune y de establecer latencia en macrófagos (López et al., 1996; Egyed et al., 1998b; Donofrio etal., 2001; Fábián et al., 2005).

Por lo tanto, además de los diferentes factores mencionados que pueden influir en la dinámica del proceso de apoptosis en las infecciones virales, en este estudio también se analizaron los genes v-Flip y v-Bcl2 en los seis aislamientos locales de BoHV-4, observándose que existen variaciones entre las cepas y que en este caso algunas de las variaciones podrían asociarse al

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En dos de las cepas correspondientes al genotipo 2 no fue posible amplificar la secuencia de ninguno de estos genes. Este resultado podría estar dado por una modificación sustancial en la secuencia nucleotídica lo que conllevaría a algún tipo de alteración en la expresión de dichos genes.

Las variaciones halladas en las cuatro cepas restantes, ocasionadas por sustituciones nucleotídicas en ambos genes, se tradujeron en cambios en las respectivas proteínas y en mayor grado en la proteína v-Flip, por lo que se podría inferir que la actividad de esta proteína presentaría variaciones dependiendo de la cepa.

En las cepas 09/227 y 07/435 (genotipo 3) una de las sustituciones se produjo dentro del dominio de homología BH3. Este dominio está involucrado en los procesos de homo y heterodimerización de los miembros proapoptóticos de la familia Bcl2. De todos modos, este dominio está pobremente conservado entre los homólogos virales (Bellows et al., 2000), por lo cual sería poco probable que la sustitución en los aminoácidos de v-Bcl2 de estas cepas pudiera originar cambios drásticos en la actividad de esta proteína, además de que no ha sido aún determinado si la conservación deficiente de la secuencia primaria de estas regiones de los v- Bcl2 pueda representar diferencias en la estructura y función de estas proteínas (Cuconati y White, 2002).

Si bien está comprobado que estas proteínas virales no poseen actividad proapoptótica (Wang

et al., 1997; Bellows et al., 2000), según los resultados de algunos ensayos experimentales in vitro, la infección con BoHV-4 podría inducir apoptosis mediante diferentes procesos. Sciortino

et al. (2000) refieren que la infección productiva con algunos gammaherpesvirus en líneas celulares susceptibles y permisivas estaría asociada con la apoptosis y no con una fase lítica, a pesar de la presencia de genes antiapoptóticos. Según los resultados de sus experimentos realizados con las cepas LVR 140 y BoHV-4 F1, estos autores hipotetizaron que esta actividad es caspasa dependiente (estaría mediada por la activación de caspasas efectoras, posiblemente 6 o 7 activadas independientemente de la caspasa 3), asociada a un ciclo productivo con altos niveles de liberación viral. Además sugieren, como resultado de un experimento con el virus inactivado, que el BoHV-4 no tendría proteínas estructurales inductoras de apoptosis. Los autores concluyen también que el efecto apoptótico podría deberse a una disminución en la regulación de la expresión del v-Bcl2, o que la expresión de genes virales en la fase tardía de la

infección podría modificar el balance del bloqueo inicial de la apoptosis. De todos modos, observaron que la inducción de apoptosis varió en función de las líneas celulares, de las dosis virales utilizadas y de los diferentes tiempos de infección. Asimismo, la variabilidad entre los diferentes experimentos fue alta. Para algunos alfaherpesvirus, como el BoHV-1, también se demostró que la inducción de apoptosis es dependiente del tipo celular, sugiriéndose que habría factores celulares específicos que intervienen en el proceso y que distintas interacciones virus- hospedador serían importantes para que el virus inicie el proceso apoptótico en diferentes tipos celulares (Geiser et al., 2008; Xu et al., 2012). Coincidentemente, Duncan et al. (1999) ya habían demostrado, en un trabajo realizado con el virus de la rubeola, que la inducción de apoptosis por efecto de la infección viral estaba afectada por la concentración viral, el tiempo de infección y la naturaleza de las líneas celulares utilizadas, dado que cada línea celular posee diferente umbral para el inicio de este proceso.

Como resultado de estudios sobre células MDBK infectadas con la cepa BoHV-4 F1 (aislamiento de un bovino con endometritis posparto), Pagnini et al. (2004) concluyeron que la apoptosis es causada por estrés oxidativo y también es dependiente de la dosis viral y del tiempo de infección. Estos autores sugieren que el estrés oxidativo podría ocurrir como consecuencia de la inhibición de síntesis de proteínas celulares durante de la infección viral. En otro experimento realizado también con la cepa BoHV-4 F1 en células MDBK (Montagnaro et al., 2013), los autores determinaron que la infección por BoHV-4 induce el mecanismo de autofagia en células susceptibles, en el estadio final de la infección.

Gillet et al. (2005) también demostraron que el BoHV-4 (cepa Vtest) induce apoptosis en células de origen tumoral in vitro e in vivo. Estos autores reportan que la apoptosis es inducida por la expresión de algunos genes inmediatos tempranos o tempranos del BoHV-4 a través de una vía que involucra la acción de la caspasa 10. Además demostraron que la inducción de apoptosis es dependiente de la dosis viral, el tiempo y del tipo celular. En el caso de las células tumorales OVCAR (adenocarcinoma de ovario humano) y A549 (adenocarcinoma de pulmón) evidenciaron que éstas eran permisivas a la infección viral, mientras que las demás líneas celulares utilizadas en los experimentos fueron pobremente permisivas y no evidenciaron