Capítulo 3 – Caracterización morfológica y molecular de la cepa nativa de
3.2 Materiales y Métodos
3.2.7 Identificación Molecular
3.2.7.1 Extracción de ADN
La extracción de ADN se realizó empleando un kit de extracción de ADN genómico GE Healthcare Illustra Nucleon Phytopure (Buckinghamshire, United Kingdom). Los pasos seguidos se muestran en la Figura 3.1
Figura 3.1: Pasos de la extracción de ADN.
Ruptura de la pared celular
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2- Se molió en mortero el material con nitrógeno líquido.
3- Se transfirió el material mediante el uso de espátula a un tubo de centrífuga.
Lisis celular
1- Se agregaron 500 µL de reactivo 1 del kit, asegurando que todos los ingredientes del reactivo estuviesen disueltos completamente. Debido a que la extracción puede contener pequeñas cantidades de ARN, se agregó una ARNasa de digestión bajo una concentración de 20 µg mL-1, después de la adición del reactivo 1. Se incubó a 37°C durante 30 minutos.
2- Se mezcló vigorosamente con espátula. 3- Se agregaron 200 µL del reactivo 2.
4- Se invirtió varias veces el tubo de centrífuga hasta obtener una mezcla homogénea.
5- Se incubó en baño de agua a 65°C. Los tubos se agitaron regularmente de forma manual durante la incubación.
6- Se colocaron las muestras en hielo durante 20 minutos.
Extracción de ADN
1- Se retiraron los tubos del hielo y se agregaron 400-500 µL de cloroformo almacenado a -20°C.
2- Se agregaron 80-100 µL de la resina de extracción de ADN Phytopure. Inmediatamente después del agregado se agitó manualmente.
3- Se agitó durante 10 minutos a temperatura ambiente. 4- Se centrifugó a 1300 g durante 10 minutos.
5- Se transfirió, mediante el uso de pipeta, la fase superior que contiene el ADN a un nuevo tubo, sin alterar la suspensión de la resina.
Precipitación del ADN
1- Se agregaron 500 µL de isopropanol frio.
2- Se agitó suavemente el tubo hasta lograr la precipitación de ADN. 3- Se centrifugó el pellet de ADN a 4000 g durante 5 minutos.
4- Se lavó el pellet de ADN con 500 µL de etanol al 70%. 5- Se descartó el sobrenadante.
6- Se secó el pellet de ADN durante 10 minutos. 7- El ADN se resuspendió en 50 µL de agua.
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3.2.7.2 Selección de primers
Las subunidades pequeñas de los genes nuclear 18S rADN y cloroplástico
rbcL fueron amplificadas mediante el empleo de los primers detallados en la Tabla 3.1.
Tabla 3.1: Primers empleados para la amplificación de los genes rbcL y 18S rADN.
Gen Secuencia de Primers (5´- 3´) Referencia
rbcL F: GATGCAAACTACACAATTAAAGATACTG Li et al. (2011)
R: ATTTTGTTCGTTTGTTAAATCCG Li et al. (2011)
18S rDNA F: CAAGTTTCTGCCCTATCAGCT Li et al. (2011)
R: ATTTTGTTCGTTTGTTAAATCCG Li et al. (2011)
NS3a F: CAAGTTTCTGCCCTATCAGCT Fawley et al.
(2005) Primer A: CCGAATTCGTCGACAACCTGGTTGATCCTGCCAGT Medlin et al. (1998) Primer B: CCCGGGATCCAAGCTTGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC Medlin et al. (1998)
3.2.7.3 Amplificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Los genes nuclear y cloroplástico, 18S rADN y rbcL, respectivamente, fueron amplificados mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés). La reacción se llevó a cabo en un termociclador Biometra TProfessional Basic empleando volúmenes de 24 µL. Los reactivos utilizados en la reacción fueron buffer 0,5x, nucleótidos fosfatados (dNTPs) Invitrogen, TAQ Polimerasa (Invitrogen Recombinante, Brasil) y agua filtrada MilliQ. Los volúmenes empleados de cada reactivo se muestran en la Tabla 3.2.
Tabla 3.2: Solución de reactivos de PCR utilizada para la amplificación de los genes rbcL
y 18S rADN. Reactivos Volumen (µL) Buffer 2,50 Cl2Mg 2,50 dNTPs 1,75 Primer 1 0,50 Primer 2 0,50 TAQ polimerasa 0,30 ADN templado 1,00 Agua MilliQ 14,95 Volumen Total 24,00
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En primer lugar, se cargó el volumen de ADN en tubos de PCR y luego se agregaron los reactivos restantes. La enzima TAQ polimerasa se agregó en último lugar con el fin de evitar su desactivación.
Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: una desnaturalización inicial a 95°C durante 2 minutos, seguida de 30 ciclos de amplificación a 94°C durante 40 segundos, 52°C durante 40 segundos y 72°C durante 40 segundos, y una extensión final a 72°C durante 3 minutos.
3.2.7.4 Electroforesis en gel de agarosa
Para la preparación del gel se empleó agarosa (D1, Conda, Laboratorio Pronadisa). En primer lugar, se preparó una solución de 40 mL de agarosa en buffer 0,5x al 1%. Para ello, se pesaron 0,4 g de agarosa en balanza analítica y se agregaron al buffer. La solución de calentó en horno microondas durante unos minutos, agitando regularmente hasta lograr que la agarosa se disuelva completamente. Una vez que la solución se volvió homogénea, se retiró del microondas y se llenó la cuba electroforética.
Luego, se sembraron en las calles del gel 4 µL del producto de la PCR y 1 µL del marcador de peso molecular, constituido por glicerol y azul de bromofenol. Se aplicó un voltaje de 90V durante 40 minutos para la electroforesis. Transcurrido el tiempo, se tiñó el gel con bromuro de etilo durante 10 minutos y finalmente se reveló en un autorrevelador.
3.2.7.5 Secuenciación de los productos 18S rADN y rbcL
Los productos de la amplificación fueron secuenciados mediante el método Sanger (Applied Biosystems 3730XL). Las secuencias fueron depositadas en GenBank con los números de acceso KF010153 y KF010154 para rbcL y 18S rADN, respectivamente.
3.2.7.6 Búsqueda de secuencias de nucleótidos
Para realizar los alineamientos, se realizó una búsqueda de las secuencias de nucleótidos de los genes 18S rADN y rbcL de las especies de Nannochloropsis
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aquellas secuencias con formato PLUS-PLUS y con un alto porcentaje de cobertura (90%) y elevado valor E (0,99). Los números de acceso de la base de datos GenBank, los datos taxonómicos y los sitios de colección de las especies
de Nannochloropsis empleadas en los alineamientos se observan en la Tabla 3.3.
Tabla 3.3: Datos taxonómicos, sitios de colección y números de acceso de GenBank de
las especies y cepas de Nannochloropsis empleadas en los alineamientos para los genes
rbcL y 18S rADN.
Especies Cepas Sitios de colección
Número de Acceso de GenBank rbcL 18S rADN N. oceanica CCALA 978 Southwestern Ocean
Atlantic Cost KF010153 KF010154
N. oculata CCAP 849 Skate Point,Isle of Cumbrae,
Scotland, UK AB052286 -
N. oculata CCMP525 Skate Point, Isle of
Cumbrae, Scotland, UK HQ710609 AF045044
N. oculata CCMP533 Lake of Tunis, Tunesia,
North Africa - AY045045
N. granulata MBIC10054
Pacific Ocean, 32°12‘ N,
147°23‘ E AB052280 AB052272
N. granulata BDH02 Unknown KC 128502 KC128500 N. granulata CCMP1662 Skagerrak, North Sea - AF045041
N. granulata Skagerrak, North Sea NGU38903
N. limnetica KR1998
Arrowodd National Wildlife Refuge, Itasca Lake Park,
Minessota, USA
DQ977729 -
N. limnetica JL1125
Arrowodd National Wildlife Refuge, Itasca Lake Park,
Minessota, USA
DQ977730 -
N. limnetica DML1114
Arrowodd National Wildlife Refuge, Itasca Lake Park,
Minessota, USA
DQ977740 -
N. limnetica AS39
Arrowodd National Wildlife Refuge, Itasca Lake Park,
Minessota, USA
DQ977741 DQ977726
N. limnetica AS2168
Arrowodd National Wildlife Refuge, Itasca Lake Park,
Minessota, USA
DQ977739 -
N. limnetica SAG1899
Lake Roter See, Mecklenburg-Vorpommern,
Germany
AM421006 AF251496
N. limnetica JL24
Arrowodd National Wildlife Refuge, Itasca Lake Park,
Minessota, USA
- DQ977727
N. gaditana MBIC10118 Shell Beach, Australia AB052279 AB052269 N. gaditana MBIC10123 Monkey Mia, Australia AB05273 AB052271 N. gaditana MBIC10418 Atlantic Ocean, Cape Town,
South Africa AB052735 AB052271
N. gaditana Ferrara & Andreoli 2004
Comachio Lagoon, Ferrara,
Italy - AF133819
N. gaditana IVP Unknown - AB473733
N. gaditana CCAP849/5-
CCMP1775 Cadiz Bay, Cadiz, Spain - AF067957
N. gaditana CCMP526 Lagune di Quadilia, Morocco - AF045037
N. gaditana B Unknown - JF444989
N. gaditana CCAP849/5-
CCMP1775 Cadiz Bay, Cadiz, Spain - AF045036
N. salina CCAP849/2 Skate Point, Isle of
Cumbrae, Scotland, UK AB052288 AF045046
N. salina MBIC10063 Pacific Ocean, 41°28‘N,
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N. oceanica MBIC10179 Red Sea, Eilat, Israel AB052283 AB052275 N. oceanica MBIC10176 Mediterranean Sea, Haifa,
Israel AB052272 AB052274
N. oceanica MBIC10426 Red Sea, Eilat, Israel AB052284 AB052276 N. oceanica MBIC10440 Red Sea, Eilat, Israel AB052285 AB052277 N. oceanica MBIC10090 Pacific Ocean, Off Sanriku,
Japan AB052281 AB052273
N. oceanica LAMB001 Unknown HQ201773 -
N. oceanica EUS001 Unknown - HQ710567
N. oceanica CCAP211/46 Kuwait - AF045034
N. oceanica CCAP211/78 Unknown - AF045035
Nannochloropsis sp.1 CCMP531 Qingdao, China - U41094 Nannochloropsis sp.2 CCMP505 Morehead City, USA - U41050 Nannochloropsis sp. UTEX2379 Unknown - AY560119
3.2.7.7 Análisis filogenético y construcción de árboles filogenéticos
Los análisis filogenéticos fueron realizados separadamente para cada gen. Los análisis de Máxima Parsimonia (MP) se realizaron con el programa PAUP*4b10 (Swofford et al. 2002). Para el análisis de MP, los caracteres fueron no ponderados y se usó la opción búsqueda heurística con el método de bisección y reconexión branch-swapping con la adición aleatoria de 10 repeticiones.
Los análisis de máxima verosimilitud (MV) fueron realizados con el programa GARLI 0,951 (Zwickl 2006), bajo el modelo General de tiempo reversible con los parámetros para sitios variables y tasa de heterogeneidad gamma-distribuida.
Como outgroups se eligieron Pseudotraedriella (EF044311), para el análisis basado en el gen 18S rADN y Eustigmatus magnus (AB280615), y Vischeria helvetica (HQ710612) para los análisis basados en el gen rbcL. Tanto para MP como para MV se realizaron réplicas de 100 bootstraps.