4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.3 MANEJO EN LABORATORIO
4.3.5 IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA
La identificación de las muestras que fueron analizadas solo morfológicamente se basó en las características de los cuerpos fructíferos de los cuales se logró una identificación hasta especie en base a secuencias del ADNr y morfología. Se analizó las principales características que presentaban estos basidiocarpos y se los comparó con los especímenes que no fueron secuenciados. Para el análisis de las características morfológicas se usó como base las utilizadas por Wang et al.(2012) y Ryvarden (2004).
Las características morfológicas utilizadas fueron: apariencia pilear (lacado, no lacado, opaco más colores del píleo), superficie pilear (reniforme y cóncavo, reniforme y convexo, reniforme y plano, circular y cóncavo, circular y convexo), grosor del píleo (> 1cm grueso, <1cm delgado), corteza pilear (dura=no ingresa la uña, suave=ingresa la uña), estípite (presente, ausente), adherencia del estípite (central, lateral), longitud del estípite (mayor al radio del píleo=largo, menor al radio del píleo=corto), color del contexto café, café-negro, negro, blanco, blanco-amarillento), depósitos de resina (si, no), color del himenio (blanco, blanco-amarillento, blanco-café), poros por milímetro (número de poros en 1 mm lineal) color esporada, forma esporas, tamaño esporas, sustrato (troncos en descomposición, raíces), y además la región natural donde habita, siguiendo la clasificación de regiones naturales del Ecuador establecida por Ron et al. (2014) ( BMO:
Bosque Montano Oriental. BHTA: Bosque Húmedo Tropical Amazónico. BHTC: Bosque Húmedo Tropical del Chocó. BDC: Bosque Deciduo de la Costa. BMOC: Bosque Montano Occidental. CTA: Cosmopolita). El número de poros por milímetro se lo obtuvo del promedio de las muestras analizadas, pero en el caso de los especímenes que solo contaban con 1 muestra, ésta fue la única medición.
Las basidiosporas fueron fotografiadas bajo un microscopio eléctrónico de barrido en el Instituto Nacional de Investigación y Salud Pública (INSPI). Las esporas de las coleccionesa G202 y G195 fueron fotografiadas en el Fungario QCA(M). El tamaño de las esporas de largo por ancho en μm se lo calculó del rango de tres esporas de cada esporada obtenida, esto se lo realizó para las muestras G102, G219 y G220. Para las muestrasa G202 y G195 se midió el tamaño de largo por ancho en μm de 16 y 10 muestras respectivamente y se obtuvo el rango de tamaño. Se analizaron las esporadas de estas muestras ya que eran las únicas esporas jóvenes y en buen estado disponibles al momento de realizar las fotografías.
5. RESULTADOS
5.1 MUESTREO
Se obtuvo un total de 156 colecciones pertenecientes a la familia Ganodermataceae en las 14 localidades visitadas. Se obtuvieron registros fotográficos del cuerpo fructífero de las especies de Ganoderma tanto de la parte adaxial como abaxial, de las esporas, del
crecimiento miceliar, y del número de poros por milímetro (Figura 4); mientras que las especies de Amauroderma fueron fotografiadas por la parte adaxial y abaxial, y además el
número de poros por milímetro (Figura 5). Los resultados de las características morfológicas analizadas se pueden observar en la Tabla 3 y se describen más adelante.
De las 156 colecciones se obtuvo cultivo puro de 117 muestras, 39 muestras no crecieron o se contaminaron en el medio de cultivo. De los 117 cultivos puros se preservaron 82 muestras, a mediano plazo, que se encuentran en el Fungario QCA(M) de la PUCE. Treinta y cinco muestras no crecieron en el sustrato de almacenamiento.
Se obtuvo la secuencia de la región ITS de 54 muestras. En 42 muestras se realizó la extracción de ADN del micelio obtenido en un cultivo puro, y de 12 muestras se realizó la extracción de ADN directamente del cuerpo fructífero (Tabla 4). Hubo 102 muestras que se identificaron únicamente en base a características morfológicas (Tabla 3). Esto se debe a que solamente podían ser secuenciadas un número determinado de muestras, por lo que se dio prioridad a la diversidad.
Para el género Ganoderma de las 128 muestras obtenidas, 118 se encontraron
creciendo como saprófitos en troncos en descomposición mientras que solamente 10 colecciones se las encontró creciendo sobre raíces (Figura 6). Los hospederos se encontraban en un muy avanzado estado de pudrición por lo que no se pudo realizar su identificación taxonómica del hospedero.
Los cuerpos fructíferos del género Amauroderma, a diferencia de Ganoderma, se
los encontró principalmente en las raíces de sus hospederos, de las 22 muestras obtenidas, 17 crecían sobre raíces (Figura 6). Pero, al igual que en Ganoderma, el hospedero se
encontraba en un estado avanzado de pudrición lo cual impidió su identificación taxonómica.
Se obtuvo registro fotográfico de las 13 especies de Ganoderma (Figura 7) y tres
especies de Amauroderma (Figura 8) identificadas únicamente hasta género. Las muestras
008 2-1, 008 2-2, G197 y CB217 identificadas como Amauroderma sp. no fueron
fotografiadas.
Se obtuvo la esporada de 17 muestras de Ganoderma. En la Figura 9 se observa el
óptimo estado del basidiocarpo en esporulación. Se obtuvo fotografías electrónicas de las basidiosporas de las muestras: G219 (Ganoderma sp5), G102 (G. parvulum), G220 (G. stipitatum). El tamaño de las esporas fue 8-9 x 3-5 μm para Ganoderma sp5, 7-9 x 4-6 μm
para G. subfornicatum y 7 x 4-5 μm para la muestra G220 identificada como G. stipitatum
(Figura 4). Las esporas de G. applanatum (G195) y G. parvulum (G202) fueron
fotografiadas en un microscopio óptico con un aumento de 100x obteniendo una medida de 9 x 6 μm para G. parvulum y 5-7 x 3-4 μm para G. applanatum.
5.2 CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS
Morfológicamente las características más relevantes de las cuatro especies identificadas de Ganoderma y dos de Amauroderma fueron:
G. applanatum: Basidiocarpo no lacado, de diámetro entre 5 a 29 cm, con una
corteza pilear dura. En la mayoría de casos no presentó estípite, su contexto era café-negro y sin depósitos de resina. El himenio era blanco con 6-7 poros por milímetro (Figura 4). Todas las muestras encontradas se encontraban creciendo sobre troncos en descomposición (Figura 6). Su esporada era café, con basidioesporas elipsoides truncadas en el ápice y con un tamaño de 8-9 x 3-5 μm (Figura 4).
G. subfornicatum: Presentaron cuerpo fructífero lacado, café-rojo con bandas
amarillas o anaranjadas, con estípite (Tabla 3) y como sustrato de crecimiento troncos en descomposición (Figura 6). Poseen un himenio blanco que se vuelve oscuro al tocarlo, con 4-5 poros por mm y contexto de color café. Las basidioesporas eran elipsoides midiendo 7 x 4-5 µm (Figura 4). Se los encontró creciendo en BMO, BHTA, BHTC y BMOC.
G. parvulum: Cuerpo fructífero lacado, rojo vino, con basidioma grande (>1.7–5.5
× 2.2–4 × 0.7–1.3 cm). El estípite se adhiere centralmente al píleo, no se observaron bandas resinosas oscuras en su contexto café, con himenio blanco amarillento, y 5 a 6 poros por mm. Las esporas eran elipsoides truncadas en el ápice y midiendo 9 x 6 µm (Figura 4). A esta especie se la encontró únicamente en un BDC.
G. stipitatum: Cuerpo fructífero lacado rojo-café, volviéndose morado con celeste
al estar seco y viejo. Con himenio blanco-amarillento, contexto blanco, y depósitos de resina sobre los tubos. Presentó 4-5 poros por milímetro, con esporas elipsoides y midiendo 7 x 4-5 μm (Figura 4). Todas las muestras se encontraron en troncos en descomposición (Figura 6) y únicamente en los BHTC.
A. praetervisum: Basidiocarpo opaco color azul con bandas rojas y anaranjadas,
estípite con adhesión central o lateral, su contexto e himenio de color blanco y sin bandas resinosas. Con 5-6 poros por mm y se lo encontró creciendo sobre raíces en un BHTA.
A. schomburgkii: Basidiocarpo opaco café con bandas café oscuro, estípite con
adhesión central o lateral, su contexto blanco-amarillento, y sin resina. Con himenio blanco-café y 5-7 poros por milímetro. Se lo encontró creciendo sobre raíces en un BHTA.
La descripción completa de todas las características analizadas se lo puede observar en la Tabla 3.
5.3 IDENTIFICACIÓN
De las 156 muestras obtenidas, el 82,0% pertenecen al género Ganoderma, el
14,1% a Amauroderma y el 3,9% de las colecciones fueron identificadas únicamente hasta
el nivel de familia. El 63,3% de las colecciones pertenecientes a Ganoderma fueron G. applanatum, el 3,9% G. cf. applanatum, el 1,6% G. aff. applanatum y el 13,3% G. subfornicatum. Se encontró solamente 1 muestra (0,8%) de G. parvulum y3 (2,3%) de G.
stipitatum. El 14,8% (19 muestras) de los Ganodermas encontrados fueron identificados
como Ganoderma sp. De las 22 colecciones de Amauroderma el 9,1% pertenecen a A. praetervisum, el 18,2% a A. schomburgkii y el 72,7% fueron identificadas como Amauroderma sp.(Tabla 2).
5.4 ANÁLISIS FILOGENÉTICO
El árbol filogenético resultante del análisis de máxima verosimilitud presenta 10 clados principales: 8 clados que agrupan a las diferentes especies de Ganoderma, 1 clado
de Amauroderma, y el grupo externo con T. colossus (Figura 10).
El primer clado (C1) cuenta con muestras de G. applanatum de regiones
temperadas de: Alemania, Hungría y Estados Unidos con un soporte del 98,0%. El segundo clado (C2) con un soporte del 100,0% forma 2 grupos: el primer grupo con 4 colecciones brasileñas identificadas como G. orbiforme, en el segundo grupo se encuentra
la especie G. subfornicatum con 12 especímenes del Ecuador junto con uno de Guyana
Francesa.
El tercer clado (C3), con un soporte del 98,0%, se encuentra la especie G. parvulum
con la muestra ecuatoriana G202 junto con 2 muestras brasileñas.
En el cuarto clado (C4) se encuentran las muestras G150 y G219 identificadas como Ganoderma sp5, este cuenta con un soporte del 95,0%.
El quinto clado (C5) comprende al género Amauroderma y contiene 3 subclados.
El primer subclado con un soporte del 99,0% cuenta con la especie A. praetervisum con 2
grupos: el primero con la muestra REC18707 de Brasil y el segundo con 2 colecciones ecuatorianas (G104 y G185) y 1 brasileña GOMEZSILVA909; el segundo subclado incluye la especie A. schomburgkii con un soporte del 100,0%, con las muestras
ecuatorianas G211, G106 y CB214 y 3 colecciones brasileñas. El tercer subclado, con un soporte del 99,0%, comprende a solamente colecciones ecuatorianas identificadas como
Amauroderma sp.con 2 grupos: el primero con las muestras 008 2-1, G75, G197, y 008 2-
2, identificadas como Amauroderma sp2, y el segundo grupo con las colecciones G131,
CB217, CB112, G213, G149 y G148 identificadas como Amauroderma sp3.
El sexto clado (C6) con un soporte del 100% contiene las muestras ecuatorianas de
Ganoderma sp. ASL828 y G198 identificadas como Ganoderma sp12 y Ganoderma sp10
respectivamente.
El séptimo clado (C7), que comprende a G. applanatum, tiene un soporte de bootstrap del 78% y cuenta con 3 grupos. El primero con muestras de Costa Rica,
Sudáfrica, Reino Unido y Estados Unidos. El segundo grupo cuenta con colecciones asiáticas de China y Corea, y el tercer grupo, presenta todas cepas tropicales donde se encuentran las 15 muestras ecuatorianas junto con muestras de Costa Rica, Guyana Francesa, Puerto Rico y Estados Unidos (Florida).
El octavo clado (C8) con un soporte del 100% contiene 2 colecciones ecuatorianas (G114 y G220) identificadas como G. stipitatum, una cubana de G. weberianum y una
El noveno clado (C9) comprende a las colecciones ecuatorianas de Ganoderma sp.
Posee un soporte del 80% y lo conforman 2 grupos: en el primer grupo se encuentra la muestra G201, identificada como Ganoderma sp9,y en el segundo grupo se encuentran las
muestras G200, G96, G126, G97 y G199 identificadas como Ganoderma sp1, y G110
identificada como Ganoderma sp3.
En el décimo clado (C10) se encuentra el grupo externo conformado por la especie
T. colossus. Este tiene un soporte del 100% y alberga a 2 colecciones, 1 brasileña y 1
6. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
En el presente estudio se identificó a 54 muestras pertenecientes a la familia Ganodermataceae por secuencia de la región ITS del ADNr y su morfología, y otras 102 muestras fueron identificadas únicamente por morfología. Además, se encontraron cuatro especies de Ganoderma y dos de Amauroderma ya descritas, se identificaron 13 especies
de Ganoderma y tres de Amauroderma que posiblemente sean nuevas para la ciencia,
aunque estudios adicionales son necesarios para aseverar esto. Se demostró que las muestras ecuatorianas de G. subfornicatum, G. parvulum, G. stipitatum, A. schomburgkii y A. praetervisum se encuentran cercanamente relacionadas con otras cepas neotropicales de
Brasil, mientras que las colecciones de G. applanatum se encuentran claramente
diferenciadas de muestras de zonas temperadas y cercanamente relacionadas con colecciones neotropicales.
Las especies G. subfornicatum, G. parvulum y G. stipitatum, según Ryvarden
(2004), son neotropicales. Torres et al. (2012) y Gomes-Silva et al. (2011) presentan
registros de G. parvulum y G. stipitatum en Brasil, Belice, Bolivia, Surinam, Nicaragua,
Costa Rica, Perú y Venezuela; y de G. subfornicatum en Belice (Torres et al., 2012). Sin
embargo, en la base de datos GenBank solo existen registros de muestras de Brasil y Guyana Francesa, por lo que sería necesario obtener datos para otras regiones geográficas y de los países donde han sido reportadas, para poderlas comparar con las muestras del Ecuador.
Las muestras de G. subfornicatum ecuatorianas se encuentran cercanamente
Francesa según el análisis filogenético. En cuanto a las características morfológicas, las muestras ecuatorianas de G. subfornicatum son similares entre sí y afines con las descritas
por Wang et al. (2014), Torres et al. (2012), Gomes-Silva et al. (2011) y Ryvarden (2000)
para la especie G. orbiforme, teniendo como diferencia el tamaño de la espora. Analizando
la filogenia del presente estudio se puede observar que las colecciones ecuatorianas de G. subfornicatum forman un clado (C2) separado de las muestras brasileñas de G. orbiforme.
Las características morfológicas son importantes para la determinación de una especie. Sin embargo como se mencionó anteriormente puede existir una plasticidad fenotípica dependiendo de las variaciones ambientales. Por tal motivo, se sugiere que las colecciones ecuatorianas corresponden a G. subfornicatum, pero no se descarta la posibilidad de que
análisis de loci adicionales pudieran revelar que las muestras ecuatorianas son conespecíficas con G. orbiforme de Brasil. Wang et al. (2014) proponen que G. orbiforme
es una especie con un amplio rango de variabilidad morfológica, según análisis de nrDNA y mtDNA ellos afirman que G. cupreum, G. densizonatum, G. limushanense, G. mastoporum, G. orbiforme y G. subtornatum son conespecíficos; todos siendo sinónimos
de G. orbiforme. Se sugiere analizar loci adicionales para poder confirmar la identidad de
las colecciones ecuatorianas. No existen estudios de esta especie en otras regiones
geográficas por lo que se necesitarían análisis del ADNr de muestras de otras regiones del mundo para poder comparar semejanzas y diferencias con las muestras obtenidas.
La muestra G202 identificada como G. parvulum del Ecuador, está cercanamente
relacionada con las colecciones neotropicales URM2948 y URM80765 de Brasil. Morfológicamente Torres et al. (2012) y Ryvarden (2000, 2004) coinciden en que esta
especie es sinónimo de G. stipitatum. La filogenia del presente estudio sugiere que G. parvulum y G. stipitatum son especies diferentes. Sin embargo se necesitaría un muestreo
más exhaustivo de esta especie y estudios adicionales para poder aseverar esto. La muestra G202 obtuvo un porcentaje de cobertura del 100% y una identidad del 98% con la especie
G. parvulum de Brasil. Morfológicamente presenta varias diferencias con las descripciones
hechas por Torres y Guzmán (2012) para G. parvulum. Posee un basidioma grande, mayor
a 1.7–5.5 × 2.2–4 × 0.7–1.3 cm, con un contexto café, y no presenta depósitos de resina. Es posible que estas diferencias se deban a la naturaleza pleomórfica de algunas especies de
Ganoderma (Ryvarden, 1994; Ryvarden, 2000) como respuesta a variaciones ambientales.
La especie G. applanatum es cosmopolita y está ampliamente distribuida, adaptada
tanto a regiones tropicales como temperadas; y ha sido reportada como patógena de coníferas, angiospermas y palmas (Paterson, 2007; Flood et al., 2000). En el análisis
filogenético se observa que las muestras analizadas de G. applanatum en este estudio son
polifiléticas de acuerdo a su origen geográfico, confirmando lo dicho por Hong y Jung (2004). El clado formado solo por individuos de G. applanatum neotropicales se diferencia
de otros G. applanatum de regiones temperadas asiáticas, estadounidenses y europeas. Se
sugiere que esta diferencia se debe principalmente a eventos de diversificación por procesos de dispersión de esporas a largas distancias (Moncalvo y Buchanan, 2008).
Antiguamente se creía que la diversificación de G. applanatum, al igual que
muchos otros organismos, se dio con la separación de Gondwana de Laurasia hace 120 millones de años (Ladiges et al., 1991; Moncalvo y Buchanan, 2008). Sin embargo,
actualmente, gracias a análisis de la región 18s del ADNr, la hipótesis más aceptada es que la diversificación de G. applanatum se dio hace 30 millones de años (Moncalvo y
Buchanan, 2008). En el hemisferio sur existe evidencia de que G. applanatum divergió
Argentina, pero no existe evidencia de este suceso en el neotrópico. Actualmente, se sugiere que las cepas neotropicales de G. applanatum provienen de un proceso de
radiación y diversificación en el Sud Este Asiático, seguido de pequeños periodos de colonización a larga distancia (Moncalvo y Buchanan, 2008), y se propone que las cepas neotropicales son diferentes de las cepas de regiones temperadas. Esta teoría concuerda con los datos del presente estudio. La única excepción a esta agrupación es la cepa JMCR.128 de Costa Rica, la cual se encuentra junto con cepas del Reino Unido, Estados Unidos y Sudáfrica, y es una muestra que fue colectada a 2700m, por lo que se sugiere que cumpliría con patrones de distribución similar a las cepas de regiones temperadas (Moncalvo y Buchanan, 2008).
Las características macromorfológicas de G. applanatum (Tabla 3) de las muestras
ecuatorianas analizadas en este estudio coinciden con las descripciones realizadas por Torres y Guzmán (2012) y Kuo (2004) para la especie. El amplio patrón de distribución de
G. applanatum en el Ecuador es similar que a nivel global, encontrándose en cinco de las
seis regiones naturales donde se realizaron colectas (Tabla 2).
Las muestras ecuatorianas de G. stipitatum se encuentran cercanamente
relacionadas con G. weberianum de Cuba y G. stipitatum de Colombia. Según Murril
(1908) existe registro de G. stipitatum en Norte América, pero no existen registros de
ADNr de esas colecciones para poder compararlas con las obtenidas en el presente estudio.
Las colecciones G114 y G220 fueron identificadas como G. stipitatum en base a
análisis moleculares, y a la morfología según la descripción de Ryvarden (2000). Todas las muestras fueron colectadas en la misma localidad, Bilsa, que pertenece a la región natural
de Bosque Húmedo Tropical del Chocó (Figura 1). La filogenia nos muestra que esta especie es afín a G. weberianum. Según Torres et al. (2012) la característica morfológica
más importante de G. weberianum es que su contexto cambia de blanco a amarillo al
momento de realizar un corte, a diferencia de G. stipitatum que muestra bandas resinosas
oscuras en su contexto.
Las muestras G114, G124 y G220 mantuvieron su contexto pálido después de realizar el corte y se observaron bandas resinosas oscuras justo por encima de los tubos que resaltaban con el contexto café pálido. Las esporas obtenidas de las muestras ecuatorianas son más pequeñas que las descritas por Torres et al. (2012) para G. weberianum, y
coinciden con las descritas por Ryvarden (2000) para G. stipitatum (Tabla 3). Por lo que
posiblemente hubo un error al momento de designar especie para la muestra G. weberianum.
Hubieron varias colecciones ecuatorianas identificadas como Ganoderma sp., según
el análisis filogenético, que se encuentran distribuidas en los clados cuarto (C4), sexto (C6) y noveno (C9). No existen muestras a nivel regional ni mundial que se relacionen con estas
muestras, por lo que posiblemente pudieran ser especies nuevas para la ciencia.
Las muestras del cuarto clado (G150 y G219) filogenéticamente son la misma especie. Además ambas muestras pertenecen a la misma región natural, BHTC, poseen características morfológicas similares entre si y su forma de vida así como su sustrato de crecimiento fueron similares. Morfológicamente ambas muestras son afines a G. applanatum. Sin embargo debido a la problemática morfológica mencionada
anteriormente, se concluye que estas muestras son un grupo taxonómico diferente identificadas como Ganoderma sp5.
El sexto clado (C6) de colecciones ecuatorianas de Ganoderma sp. cuenta con las
muestras G198 (Ganoderma sp10) y ASL828 (Ganoderma sp11). La filogenia sugiere que
ambas colecciones están cercanamente relacionadas y podrían ser la misma especie; sin embargo, según las características morfológicas, sustrato de crecimiento, forma de vida y región natural analizadas, estas colecciones no muestran coincidencia. Es posible que el análisis de loci adicionales ayude a esclarecer la identidad de estas muestras. Se sugiere investigar los loci de genes codificadores de proteína como por ejemplo: RPB1, RBP2 o TEF1-alpha ya que estos genes se ha comprobado que son útiles en la reconstrucción filogenética a varios niveles taxonómicos en Agaricomycetes y han ayudado en la clasificación taxonómica de Trametes, un género cercanamente relacionado a Ganoderma,
ya que son genes conservados. Por lo que su análisis podría ayudar a dilucidar mejor los resultados obtenidos (Carlson et al., 2014;Justo y Hibbet, 2011).
Las muestras incluidas en el noveno clado (C9) de colecciones ecuatorianas de
Ganoderma sp. tienen la particularidad de que todas se encuentran creciendo como
parásitos sobre raíces; a diferencia de la mayoría de Ganodermas colectados en este estudio que se los encontró creciendo como saprófitos. Ryvarden (2004) menciona que
Ganoderma puede ser parásito y que generalmente crece en troncos, pero también existen
registros de Ganodermas que crecen sobre raíces (Bakshi et al., 1975). No obstante, estas
muestras no presentan una correlación con el área geográfica o las regiones naturales