Imágenes de alto contraste mediante filtrado temporal con NPs dopadas con iones Nd 3+

Hasta ahora, hemos descrito cómo obtener imágenes infrarrojas libres de autofluorescencia aprovechándonos de una de las características de ésta: su baja intensidad a longitudes de onda relativamente largas. La fluorescencia de los compuestos orgánicos responsables de la autofluorescencia tiene, sin embargo, otra propiedad que pudimos aprovechar para conseguir imágenes de alto contraste: su extremadamente corta vida media. Debido a que las emisiones de fluorescencia de los compuestos orgánicos se generan a partir de transiciones permitidas, sus tiempos de vida media están, generalmente, en el orden de los nanosegundos. Al tratar de determinar experimentalmente el decaimiento temporal de la autofluorescencia, observamos que éste era demasiado rápido para poder ser detectado con nuestro sistema experimental, cuyo tiempo de respuesta está en el orden de los 8 ns. Este rápido decaimiento contrasta con las largas vidas medias (típicamente, del orden de

microsegundos) que presentan las NPs dopadas con iones Nd3+_{, como describimos en} la sección 2.1.1.

Esta gran diferencia entre los tiempos de vida media de fluorescencia de los compuestos orgánicos responsables de la autofluorescencia y las NPs dopadas con iones Nd3+ _{nos sirvió como punto de partida para desarrollar un sistema de filtrado} temporal capaz de generar imágenes infrarrojas libres de autofluorescencia. El objetivo de este sistema era eliminar la contribución de las señales de vida media más corta a la imagen. A la hora de trabajar con NPs dopadas con iones Nd3+_{, resulta más adecuado} utilizar esta técnica de filtrado temporal que la de filtrado espectral mostrada en la sección anterior. Esto se debe a que obtener imágenes libres de autofluorescencia mediante filtrado espectral requiere seleccionar longitudes de onda superiores a los 1200 nm. En el caso de las NPs dopadas con iones Nd3+_{, esto implicaba seleccionar} únicamente la banda de emisión centrada en torno a 1340 nm, que como indicamos anteriormente, no representa más de un 20 % de la emisión total. En cambio, utilizando la técnica de filtrado temporal, sería posible obtener imágenes libres de autofluorescencia aprovechando más eficientemente la emisión de los iones Nd3+_{, al no} ser necesario eliminar la contribución de las bandas centradas en torno a 890 y 1060 nm.

Para llevar a cabo el filtrado temporal de las imágenes, modificamos nuestro sistema de imagen infrarroja sustituyendo el láser continuo utilizado como fuente de excitación por un láser pulsado con el objetivo de utilizar el final del pulso láser como disparador de la cámara infrarroja. Como se explica en detalle en la sección 3.2.2, entre el láser y la cámara introdujimos un circuito retardador que permitía comenzar la adquisición de imágenes un determinado tiempo (tr, entre 1 y 200 µs) después del final

de cada pulso láser.

A modo de ejemplo representativo, en este apartado se mostrarán los resultados obtenidos para NPs de NaGdF4:Nd3+ de 500 nm de diámetro, que presentaban un tiempo de vida media (obtenido a partir de la curva de decaimiento mostrada en la Figura 4.12 (a)) de 90 ± 7 µs. La elección de estas NPs, cuyo tamaño es relativamente

elevado en comparación con el del resto de sistemas estudiados en esta tesis, estuvo motivada por su especialmente larga vida media. Como se indicó en el capítulo 2, las vidas medias de fluorescencia de los iones Nd3+ _{presentes en las NPs difieren} sustancialmente de las vidas medias de estos iones observadas en los materiales en volumen y dependen de numerosos factores. Entre ellos, el tamaño de las NPs es un factor clave, de forma que NPs de idéntica composición presentan vidas medias más largas cuanto mayor es su tamaño. Podemos ver en la Figura 4.12 (a), a modo de comparación, la curva de decaimiento de las NPs de NaGdF4:Nd3+ de 20 nm diámetro. La vida media de estas NPs, obtenida a partir del ajuste exponencial mostrado en la figura, era de 3.2 ± 0.2 µs. Para comprobar que el sistema de filtrado temporal, efectivamente, adecuado para nuestro objetivo de eliminar la contribución de la autofluorescencia sin reducir de forma significativa la señal de las NPs, estudiamos el efecto sobre ambas emisiones de introducir un tiempo de retardo mínimo (tr = 1 µs) en

la adquisición de imagen. Podemos ver las imágenes infrarrojas obtenidas (en el rango completo de detección de la cámara, 900-1700 nm) bajo excitación con un láser de 808 nm para un pellet alimentario y una cubeta rellena con una dispersión acuosa de NPs de NaGdF4:Nd3+ en la Figura 4.12 (b). Mientras que ambas muestras presentaban fluorescencia infrarroja si no se introducía retardo entre el final del pulso y la adquisición de la imagen, un tiempo de retardo de 1 µs fue suficiente para hacer indetectable la contribución de la autofluorescencia sin afectar prácticamente a la intensidad emitida por las NPs de NaGdF4:Nd3+. Al incrementar el tiempo de retardo entre el fin del pulso láser y la adquisición de la imagen sí observamos una disminución de la intensidad registrada, aunque incluso para el tiempo de retardo más largo (tr =

200 µs) seguimos siendo capaces de detectar la emisión de las NPs, como se puede ver en la Figura 4.12 (c).

Figura 4.12. Vida media de NPs de NaGdF4:Nd3+ e imagen con filtrado temporal. (a) Decaimiento de la fluorescencia de las NPs de NaGdF4:Nd3+ de 20 y 500 nm de diámetro. En

ambos casos se muestra el mejor ajuste a una curva exponencial. (b) Imágenes de fluorescencia infrarroja para un pellet alimentario y una cubeta que contiene una dispersión acuosa de NPs de NaGdF4:Nd3+ (500 nm de diámetro) para tiempos de retardo

de 0 y 1 µs entre el fin del pulso láser y la adquisición de la imagen. (c) Imágenes de