Impacto funcional de variantes de FSH

El crecimiento de los folículos ováricos es un proceso complejo regulado por gona- dotropinas, esteroides y factores de crecimiento (Richards et al., 2002). La hormona folículo estimulante (FSH), juega un papel esencial durante la foliculogénesis ovárica y sus acciones tienen consecuencias importantes en la fertilidad, ya que los ratones hembra con deficiencia de subunidades β de FSH o receptor de FSH son infértiles (Abel et al., 2000; Kumar et al., 1997). Esta gonadotropina no sólo regula la pro- liferación de células de la granulosa y la producción de estradiol, sino que también previene la apoptosis de las células de la granulosa y la atresia folicular (Chun et al.,

1996; Robker y Richards, 1998).

Al igual que otras hormonas glucoproteicas, la FSH se compone de una familia de variantes de glicosilación que difieren entre sí en la estructura del oligosacárido incluyendo la finalización de la síntesis de la rama, grado de ramificación y el con- tenido de ácido siálico. En modelos in vitro se ha demostrado que las variantes

de glicosilación de la FSH tienen acciones complementarias y específicas sobre los

folículos en desarrollo, y que se requiere un balance específico de glicoformas para un óptimo desarrollo del folículo (Barrios-de Tomasi et al., 2006; Ulloa-Aguirre et al.,

1999; Vitt et al., 1998). Por otro lado, el grado de bioactividad de la FSH es inver- samente proporcional al contenido de ácido siálico (Zambrano et al., 1996). En este contexto, el objetivo propuesto porLoreti(2012) yLoreti et al.(2013) fue deter- minar el posible impacto funcional de la complejidad de oligosacáridos y contenido de ácido siálico en FSH recombinante humana (FSHrh), sobre células de granulosa humana en cultivo.

4.1. Impacto funcional de variantes de FSH 151

4.1.1.

Entendimiento de datos

El modelo biológico bajo estudio fue una línea celular tumoral, similar a una gra- nulosa humana (KGN), la cual mantiene la expresión funcional del receptor de FSH y la capacidad de producir esteroides y expresar las subunidades α y βA inhibinas (Nishi et al., 2001). Las inhibinas son complejos protéicos que regulan a la baja la síntesis de FSH e inhiben la secreción de FSH. Esta línea celular es estimulada con un medio de cultivo que posee diferentes aislamientos obtenidos de la FSHrh comercial (NICHD, NIH; USA):

Análogos de carga: mediante isoelectroenfoque, se combinaron las fracciones re-

cuperadas de diferentes preparados con pH2,56a4,00para obtener una mezcla más ácida (FSHrh-AC) y análoga en carga de ácido siálico. A su vez, las frac- ciones con un pH >5,00 se combinaron para obtener una mezcla más básica

(FSH-BA), como se describe para ambas preparaciones enLoreti et al.(2013).

Isoformas con distinta complejidad de oligosacáridos: mediante cromatogra-

fía en Concanavalina A se separaron tres grupos de variantes glicosiladas de FSHrh de acuerdo a la complejidad de sus oligosacáridos retenidos por lectina:

No retenidos (NR): FSHrh con glicoformas que poseen complejos, triante-

narios y bisectrices de oligosacáridos.

Débilmente retenidos (DR): FSHrh con glicoformas que poseen cadenas

de carbohidratos biantenarios.

Fuertemente retenidas (FR): FSHrh con glicoformas que poseen un eleva-

do contenido de oligosacáridos de manosa o de tipo híbrido.

De los tres grupos anteriores sólo se utilizaron las preparaciones que no retienen (FSHrh-NR) y aquellas fuertemente retenidas (FSHrh-FR), como se describe enLoreti et al. (2013).

Las células de KGN se cultivaron en un medio con la FSHrh comercial nativa, dos aislamientos de ácido siálico (FSHrh-AC y FSHrh-BA) y dos aislamientos de complejos de oligosacáridos (FSHrh-NR y FSHrh-FR), empleando una dosis de 20 ng/ml de cada preparado y dos réplicas biológicas por cada tratamiento durante

152 Capítulo 4. Aplicaciones

24 horas. Luego se extrajo, purificó e hibridizó el ARN utilizando el microarreglo “Human Gene 1.0 ST” de AffymetrixR siguiendo el protocolo del fabricante. Se

utilizó el software del fabricante, Expression Console 1.1, para obtener los niveles de expresión de genes y las medidas de calidad/detectabilidad (call) del fabricante. Una vez obtenidos los valores de expresión del experimento, se abordaron las diferentes etapas del KDD descriptas en el capítulo2, utilizando el flujo de trabajo de la sección

3.1:

Laconversión e integridad de anotación utilizó el aporte de la sección3.2, em- pleando la anotación del fabricante en conjunto con el paquete de Bioconductor del fabricante y una actualización de los datos asociados a los IDs con e-utiles. El filtrado de datos consideró sólo aquellas sondas que poseen anotación, que codifican alguna proteína y que han sido detectadas en la totalidad de los micro- arreglos, según las métricas del fabricante obtenidas por Expression ConsoleR,

dado que se poseen sólo dos réplicas biológicas por tratamiento.

La normalización de los datos no ha sido necesaria, dado que se utilizó el algoritmo RMA-SKETCH para obtener la señal de intensidad de las sondas. Este algoritmo aplica una transformación a los valores de intensidad de manera de dejar a todos los microarreglos con la misma distribución (Affymetrix,2004). La reducción, proyección e integración de datos, fue llevada a cabo mediante el ajuste del modelo lineal de la ecuación (4.1) para cada gen del microarreglo presente en esta etapa:

yij =β0i+β1iτAC(i) +β2iτBA(i) +β3iτN R(i) +β4iτF R(i) +εij (4.1)

i= 1, . . . , N;j = 1,2

εij ∼N(0, σi2) ∧ Cov(εij, εkl) = 0 ∀ i6=k∧j 6=l (4.2)

donde:

yij es el valorlog2 de expresión del i-ésimo gen, para la j-ésima réplica

β0i representa el nivel de expresión para el control de FSHrh comercial

4.1. Impacto funcional de variantes de FSH 153

εij es el error aleatorio no observable, sujeto a los supuestos de (4.2)

τAC(i), τBA(i), τN R(i) y τF R(i) son variables binarias para indicar la pertenencia

o no (1 o 0), del i-ésimo gen al tratamiento FSHrh-AC, FSHrh-BA, FSHrh-NR y FSHrh-FR respectivamente.

El modelo (4.1) se ajustó con la librería limma de R, utilizando una corrección empírica de Bayes (Smyth et al., 2011). Se seleccionaron aquellos genes expresados diferencialmente entre cada uno de los tratamientos respecto de la situación de con- trol, es decir,H0 :βki = 0contraH1 :βki 6= 0parak = 1, . . . ,4 ∀i. Adicionalmente,

se compararon los tratamientos con diferente ácido siálico y complejidad de oligosa- cáridos. En todos los casos se utilizó un valorp <0,05y|βki|de corte, que permitiera

una correcta separación de los mapas de calor de los diferentes pares de contraste de tratamientos y suficiente información (≈ 400 genes) para la etapa de modelado como se describe en Fresno et al. (2012).

En la figura 4.1 se muestran los resultados obtenidos en la etapa de reducción, proyección e integración de expresión para los diferentes tratamientos. En el panel (a) se observan dos diagramas de Venn, con los genes diferenciales obtenidos para las comparaciones de interés biológico respecto del control (FSHrh). En este sentido, el diagrama superior compara la diferencia de genes candidatos según el contenido de ácido siálico (FSHrh-AC vs FSHrh-BA), mientras que en el inferior los genes atribuidos a la complejidad de oligosacáridos (FSHrh-NR vs FSHrh-FR). En todos los tratamientos se obtuvo una cantidad de genes en el orden de 400 individuos y una distribución similar de genes sobre o subexpresados. Note que para ambos diagramas, los tratamientos comparten en el orden de 1/4 de los genes seleccionados. Una lista completa de los genes, descripción y valores de expresión se puede encontrar en el material suplementario de Loreti et al. (2013) y en la página web www.bdmg.com. ar/?page_id=251.

En la figura4.1(b)se muestran dos mapas de calor, uno para verificar el contenido de ácido siálico y el segundo para la complejidad de oligosacáridos. En estas figuras, las filas representan los tratamientos y en columnas los genes de los microarreglos, para los tratamientos FSHrh-BA y FSHrh-FR respecto del control (FSHrh). En ambos mapas de color se aprecia el correcto agrupamiento de las réplicas biológicas de cada tratamiento. Además se puede ver el cambio en el nivel de expresión de un

154 Capítulo 4. Aplicaciones

FSHrh-AC FSHrh-BA

FSHrh-NR FSHrh-FR

(a) Genes diferenciales

FSHrh-BA FSHrh-BA FSHrh FSHrh FSHrh-FR FSHrh-FR FSHrh FSHrh (b) Mapas de calor

Figura 4.1: Reducción, proyección e integración de genes diferenciales. (a) Diagrama de Venn con los genes candidatos para las diferentes comparaciones de interés bio- lógico, respecto de la condición de control (FSHrh). Las flechas indican el sentido de sobre o subexpresión de los genes. (b) Mapas de calor para la comprobación vi- sual el agrupamiento de las réplicas biológicas para el criterio de selección utilizado. Adaptación de imágenes de Loreti et al. (2013).

4.1. Impacto funcional de variantes de FSH 155

mismo gen atribuido al cambio de tratamiento, es decir, pasa de sobre a subexpresión o viceversa. Un comportamiento similar presentan los otros dos tratamientos respecto del control, los cuales no son mostrados en la figura 4.1(b).

4.1.2.

Modelado

La etapa demodelado se llevó a cabo mediante el MRCM presentado en la sección

3.5. En este sentido, se utilizó la idea de obtener conocimiento biológico por el con- senso/discrepancia del enriquecimiento de diferentes listas de referencias (LRs), pero en este caso sobre resultados funcionales obtenidos de listas de genes provenientes de diferentes contrastes de tratamientos.

El MRCM se utiliza de forma habitual para realizar el análisis ontológico-funcional de cada una de las listas de genes empleando las tres LRs propuestas: el genoma de la especie (LR-I), los genes impresos en el microarreglo (LR-II) y aquellos detectados de manera confiable (LR-III). Posteriormente, se obtiene el grafo de enriquecimiento para cada LR a los efectos de integrar los resultados en un grafo “ampliado”, operan- do por columnas sobre los grafos que poseen un mismo color (verde, azul o naranja), como se muestra en la figura 4.2 para los contrastes que involucran diferentes conte-

LR-I

MRCM para comparar los variantes de FSHrh LR-II LR-III + = + + = + + = + = + + PB/ FM /CC FSHrh-AC vs FSHrh FSHrh-BA vs FSHrh FSHrh-AC vs FSHrh-BA MRCM MRCM MRCM

Figura 4.2: Contrastes de enriquecimiento funcional de las variantes de FSHrh rela- cionadas a diferente contenido de ácido siálico: ácidas (FSHrh-AC), control (FSHrh) y básicas (FSHrh-BA). Imagen adaptada de Fresno et al. (2012).

156 Capítulo 4. Aplicaciones

nidos de ácido siálico (FSHrh-AC, FSHrh-BA y FSHrh). De esta manera, la totalidad de información de enriquecimiento de un mismo contraste es integrada en un úni- co grafo. Un esquema similar de procesamiento se utilizó para los tratamientos que poseen diferente complejidad de oligosacáridos (FSHrh-NR, FSHrh-FR y FSHrh).

Una vez obtenido el grafo que integra los resultados funcionales de las tres LRs para cada lista de genes, se busca comparar a nivel funcional aquellos contrastes de interés biológico. Para ello se emplea la misma idea del MRCM, donde ahora el consenso/discrepancia se aplica sobre la última fila de la figura 4.2, es decir, sobre la suma de los resultados parciales obtenidos para las columnas (grafos ampliados de contrastes de variantes de FSHrh). Ahora el patrón de colores permitirá identifi- car visualmente la especificidad funcional del diferente contenido de ácido siálico o complejidad de oligosacárido de la/s variante/s de FSHrh utilizadas. Justamente, la posibilidad de integrar información funcional de diferentes listas de genes candidatos, no se encuentra disponible en ninguna de las herramientas bioinformáticas presen- tadas en la sección 1.3. Esta es una característica novel del MRCM, donde, a través de los reportes del Contraste Ontológico de la sección 3.6, es posible explorar de una manera rápida, visual y eficaz los resultados de las diferentes variantes glicosiladas de la FHSrh, sin que ello se torne en una tarea tediosa para el investigador, como se describió en el capítulo 1.

4.1.3.

Evaluación

El uso conjunto del MRCM y los reportes del Contraste Ontológico, mostraron que en el análisis de enriquecimiento funcional tanto contenido de ácido siálico como complejidad de oligosacáridos, modulan la expresión de genes implicados en la acti- vidad funcional de las células KGN como se describe en Loreti et al. (2011), Loreti

(2012) y Loreti et al. (2013).

En la figura4.3 se muestran los resultados del contraste funcional para diferente

contenido de ácido siálico en el grafo de PB de GO. En la figura se aprecia que

con el MRCM fue posible descubrir ramas funcionales asociadas a la FSHrh-AC (en color azul), nodos hoja que se diferencian entre las variantes ácidas y básicas (en colornaranja), ramas y nodos hoja asociadas a la FSHrh-BA (en colorverde) y unos pocos nodos consensuados por todas las variantes (en color rojo). Esta visualización

4.1. Impacto funcional de variantes de FSH 157 AC v s Bas al & BA vs Basal AC v s BA & BA v s Bas al AC v s BA & AC v s Bas al AC v s BA & AC v s Bas al & BA v s Bas al AC v s b asal BA v s b asal AC v s BA No enriq uecid o Figura 4.3: A daptación del MR CM para con trastar el enriquecimien to funcional de Pro cesos Biológ ic os de Gene On tology , de las v arian tes de FSHrh con diferen te con tenido de ácido siálico: ácido (FSHrh-A C), con trol (FSHrh ) y básico (FSHrh-BA). Imagen extraída de Loreti et al. ( 2011 ).

158 Capítulo 4. Aplicaciones

es de gran utilidad para la búsqueda de patrones, desde una perspectiva de la MD, donde la estructura de GO y los colores permiten una visión funcional global de las variantes de FSHrh asociadas al contenido de ácido siálico.

En particular se encontraron diferentes nodos enriquecidos por la FSHrh-AC co- mo “homeostasis celular”, “organización del nucleosoma”, “ensamblado de esteroides” y “transporte de iones de hierro”, los cuales están relacionados con el modelo bio- lógico bajo estudio. A su vez, la contraparte con menor contenido de análogos de ácido siálico (FSHrh-BA), se asoció a términos de GO enriquecidos principalmen- te en aspectos importantes del “proceso de reproducción” tales como “generación de gametos”, “regulación de la diferenciación celular” (factores de crecimiento) y “regulación de la secreción celular”. Estos términos soportan las observaciones de

Zambrano et al. (1996) donde el grado de bioactividad de la FSH es inversamente proporcional al contenido de ácido siálico.

Un grafo similar se obtuvo para las FM de GO y el diferente contenido de ácido siálico. En este sentido la FSHrh-AC se asoció a términos enriquecidos en “activi- dad esteroide deshidrogenasa”, “actividad transmembrana de glucosa”, “actividad de canales de calcio”, “unión de esteroides y ácido nucleico” y “actividad de receptores nucleares dependiente del ligando”, los cuales son rápidamente identificados de forma visual en el grafo. Bajo la misma metodología de exploración, los términos enriqueci- dos por la FSHrh-BA fueron: “ligando de factores de crecimiento”, “unión de iones de calcio”, “actividad regulada por la síntesis de óxido nítrico”, “actividad del inhibidor de endopeptidasa del tipo de serina” y “actividad de la proteína tirosina quinasa”. En este grafo los nodos consensos y aquellos asociados entre las variantes ácidas y básicas, son nodos internos a la estructura, por lo que son explicados por algunos de aquéllos biológicamente más específicos de FSHrh-AC o FSHrh-BA nombrados con anterioridad.

La exploración de la complejidad de oligosacáridos a nivel funcional fue la que brindó mayor cantidad de información sobre el modelo biológico bajo estudio. En este sentido, los grafos contenidos en el reporte del Contraste Ontológico poseen una cantidad elevada de nodos enriquecidos. Esto se atribuye directamente al grado de especificidad funcional de las variantes involucradas en la complejidad de oligo- sacáridos. A los efectos de la evaluación, en la figura 4.4 se muestran aquellos nodos

4.1. Impacto funcional de variantes de FSH 159

Figura 4.4: Extracto del grafo de enriquecimiento funcional asociado a la comple- jidad de oligosacáridos. En el panel A se presenta para Procesos Biológicos y en el B para Funciones Moleculares M. En color amarillo los nodos enriquecidos para todas las variantes de FSHrh y en celeste, aquellos específicamente relacionados a oligosacáridos no retenidos por lectina (FSHrh-NR). Imagen extraída deLoreti et al.

(2013).

relacionados específicamente con la FSHrh-NR para PB y FM en el panel A y B respectivamente. En estos grafos el MRCM resalta los nodos enriquecidos comunes a las diferentes variantes de FSHrh en color amarillo, mientras que enceleste resalta los específicos de FSHrh-NR. En el panel A se resaltan los nodos de “apoptosis” así como la “respuesta inflamatoria aguda” y la “adhesión célula-célula dependiente de calcio” vinculados a la FSHrh-NR. A su vez, en el panel B la misma variante en- riquece los términos de “actividad de liasa de carbono-carbono”, “unión de iones de calcio” y “actividad de receptores de vasopresina”, como se describe en Loreti et al.

(2013).

Por otra parte, en el panel A de la figura4.5se observa cómo la variante de FSHrh- FR afecta genes que enriquecen nodos de PB como la “biosíntesis de esteroides”,

160 Capítulo 4. Aplicaciones

(a) Procesos biológicos

(b) Funciones moleculares

Figura 4.5: Extracto del grafo de enriquecimiento funcional asociado a la complejidad de oligosacáridos. En el panel A se presenta para Procesos Biológicos y en el B para Funciones moleculares M. En color amarillo, los nodos enriquecidos para todas las variantes de FSHrh y en violeta, aquellos específicamente relacionados a oligosacári- dos fuertemente retenidos por lectina (FSHrh-FR). Imagen extraída de Loreti et al.

4.1. Impacto funcional de variantes de FSH 161

la “respuesta a estímulos de estrógeno”, “punto de control de daño intra-S en el ADN”, “desarrollo del folículo ovárico” y “metabolismo del colesterol”. Los nodos enriquecidos por esta variante en FM, se encuentran asociados a “unión de ATPasas”, “unión a receptores de interleukina-7” y “unión de oxígeno” como se muestra en el panel B de la figura 4.5.

Curiosamente, en las figuras4.4 y4.5 las ramas enriquecidas comunes a todas las condiciones experimentales estudiadas terminan en el nodo hoja de la “vía de seña- lización de receptores de proteínas-G acoplados” en el grafo de PB o en la “actividad de receptores de proteínas-G acoplados” para el grafo de FM; es decir, que tanto las variante del contenido de ácido siálico como la de complejidad de oligosacáridos enriquecen dichos nodos. De hecho, esta observación fue detectada en el grafo que incluye la totalidad de variantes de complejidad de oligosacáridos, que por razones de tamaño del grafo no ha sido incluido y que a Loreti et al. (2013) les sugiere un par de hipótesis para explorar en trabajos futuros.

Los resultados obtenidos para los grafos de CC asociados a las diferentes varian- tes glicosiladas de FSHrh no fueron concluyentes. En este sentido, no fue posible detectar patrones desde la MD sobre las “vistas de enriquecimiento” o “de expre- sión” del reporte de Contraste Ontológico que fueran de utilidad para generar nuevo conocimiento sobre el comportamiento de las KGN.

A partir de los resultados anteriores y del conocimiento biológico previo del mo- delo biológico,Loreti et al.realizaron un selección sobre los nodos hojas enriquecidos sobre PB para elegir genes candidatos para la posterior “validación biológica”. En este contexto, se seleccionó el nodo de “biosíntesis de esteroides” relacionado con actividad específica de la FSHrh-FR como se muestra en el panel A de la figura4.5. Dentro de este nodo se realizó una selección de potenciales candidatos, mediante la exploración del reporte de Contraste Ontológico mostrado en la sección 3.6.1. En este sentido, se tuvo en cuenta la integración de información de expresión de las diferentes variantes glicosiladas de FSHrh y la evidencia de artículos científicos rela- cionados los modelos de las células KGN, siguiendo los vínculos de PubMed incluidos en el reporte. De esta manera, resultaron como candidatos los genes con los símbolos STAR, HSD3B2, CYP19A1 y HSD17B para validación por RT-PCR (sección 2.5). Para todos los candidatos seleccionados, se obtuvieron resultados de expresión simi-

162 Capítulo 4. Aplicaciones

lares a los reportados para la expresión realizada por microarreglos, como se describe