Y PP2A EN MEJILLÓN POR PRIMERA VEZ:
ESTRUCTURA Y FILOGENIA
Dado el efecto conocido que produce el OA en las PPs, en este trabajo se identificaron secuencias relacionadas con PP1 y PP2A en mejillón para estudiar la posible presencia de diferencias significativas respecto a las secuencias homólogas encontradas en otras especies. Es importante destacar que estas secuencias génicas no se conocían hasta la fecha y, dada la ausencia de pruebas que muestren el compromiso de la viabilidad de los mejillones ante la presencia de OA, la caracterización de estas PPs en mejillón podría poner de manifiesto posibles diferencias en su interacción con el tóxico.
En lo referente a las dos isoformas encontradas de la subunidad catalítica de PP1, es importante destacar que se trata de la primera identificación de una isoforma PP1-like (denominada “PP1 CAT gamma”) totalmente distinta en cuanto a longitud, secuencia e historia evolutiva a cualquier otra subunidad catalítica de PP1 en invertebrados encontrada en las bases de datos, lo que podría indicar que no se trate de una proteína canónica de PP1. El hecho de que esta novedosa isoforma aparezca sólo en las genotecas reverse sugiere que pueda tratarse de un gen que se expresa más en mejillones control. Además ambas isoformas presentan diferentes patrones de expresión [ver Figura 35], observándose la sobreexpresión por término general en tratamientos más severos con OA de la isoforma gamma que podría ser indicativo de la consecución de un estado ya normal post-intoxicación.
Respecto a los análisis filogenéticos, todo apunta a la presencia de tres grandes grupos monofiléticos correspondientes con cada subunidad catalítica de PP1 conocida (alpha, beta y gamma). Esto sugiere una diferenciación funcional entre las diferentes subunidades partiendo de un antecesor común previo a la radiación de los Cordados, pues los únicos que presentan la subunidad gamma
son peces, anfibios, reptiles, aves y mamíferos, todos ellos vertebrados. Así podríamos concluir que los vertebrados por norma general presentan 3 isoformas de “PP1 CAT”, mientras que los invertebrados sólo presentan 2 isoformas (Lin et al., 1999). Lo llamativo en este punto es la localización filogenética en posiciones basales de la isoforma “PP1 CAT gamma” encontrada en mejillón, que apunta a la presencia de rasgos bastante divergentes respecto a otras subunidades catalíticas de PP1 en invertebrados
[ver Figura 36]. También es importante destacar que hasta el momento no se ha encontrado, a través de amplificaciones con múltiples cebadores degenerados, la esperada isoforma “PP1 CAT beta” que según lo esperado debería existir en invertebrados junto con la isoforma “PP1 CAT alpha”. Por comparación con otro invertebrado con mayor información genética disponible, cabe matizar que, curiosamente entre la gran cantidad de genes de
Strongylocentrotus purpuratus presentes en las bases de datos no se ha identificado más de una isoforma similar a “PP1 CAT”. Por tanto, la amplificación o no en mejillones de la isoforma beta podría ayudar a elucidar cómo pudo evolucionar la novedosa isoforma gamma ya encontrada, tanto directamente a partir de la diferenciación de la aún desconocida isoforma beta
del mejillón dejando un total de dos isoformas en estos organismos, o por duplicación y diferenciación de alguna de las restantes isoformas dando lugar a tres isoformas totales.
filogenética (incluyendo protistas, plantas y hongos) es consistente con una diferenciación funcional de las subunidades catalíticas alpha y beta a partir de un gen ancestral de invertebrados, seguido más tarde de una diferenciación de la isoforma gamma en vertebrados (Lin et al., 1999). Nótese sin embargo las diferencias presentes en las plantas, ya que, dada su demostrada capacidad para duplicar su genoma completo, se han encontrado muchas otras isoformas de PP1 (Smith et al., 1993), aunque ninguna haya presentado una homología significativa con la “PP1-like” (o “PP1 CAT gamma”) encontrada en el mejillón.
En lo referente a PP2A, los datos indican la presencia de dos grandes grupos monofiléticos alpha y beta restringidos únicamente a organismos vertebrados, lo que sugiere que esta divergencia en dos linajes (alpha y beta) ocurrió de forma temprana en vertebrados durante la evolución de los Cordados. Además, el hecho de que no exista todavía diversificación en Urocordados, nivel basal en la filogenia de Cordados, apoya la idea de que se separaron posteriormente. Estas posiciones basales en la filogenia de la subunidad catalítica de PP2A están ocupadas de nuevo por protistas, plantas y hongos, donde la diferenciación funcional en las dos isoformas (Pph21, Pph22) (Sneddon et al., 1990) se evidencia como resultado de un episodio de duplicación genómica ocurrido posteriormente al origen de los vertebrados a partir de un gen ancestral de invertebrados (Ronne et al., 1991). Sin embargo, la presencia de isoformas adicionales de la subunidad catalítica de PP2A es de nuevo extensible a plantas, donde por ejemplo, en el caso de Arabidopsis thaliana, fueron encontradas más de cinco isoformas (Ariño et al., 1993).
En este trabajo no se encontró ninguna posible isoforma adicional de la subunidad catalítica de PP2A, pero sí se encontró un posible pseudogen de la misma mediante el uso de cebadores degenerados [ver Figura 34]. Esta secuencia parcial de 601 nucleótidos, dadas las diferencias ya mencionadas
respecto a la secuencia completa y funcional de la subunidad catalítica de PP2A en mejillón, apunta muy posiblemente a una duplicación ocurrida en este gen.
Finalmente, los análisis realizados para tratar de definir la naturaleza de la selección natural mostraron diferencias entre ambas filogenias de PP1 y PP2A. En lo que respecta a PP1, dada la presencia de ratios heterogéneos de evolución, podría tratarse de episodios de selección diversificadora implicada en la diferenciación de las distintas subunidades. Tras el análisis de las filogenias, los resultados obtenidos confirman la existencia de episodios de selección diversificadora (ω > 1) en al menos cinco ramas internas en el caso de PP1 (p ≤ 0’05) [ver Figura 38].
Por el contrario, el screening de la filogenia reconstruida para PP2A revela una completa ausencia de selección diversificadora en los nodos internos que conducen a las subunidades alpha y beta[ver Figura 39].