Práctica 12
Introducción
Durante la embriogénesis somática las células en cultivo experimentan un proceso de desa- rrollo similar al que ocurre en las plantas cuando se orman las semillas. El desarrollo de un embrión tanto in vivo como in vitro está codifcado por los mismos genes. La embriogénesis somática es un proceso complejo regulado por tres programas genéticos que se prenden de orma secuenciada y son los responsables de la ormación de tejido competente para la em- briogénesis, del desarrollo y la maduración de los embriones. La obtención de un embrión ma- duro, értil y bien desarrollado depende de que estos programas se enciendan en el momento adecuado.
Generalmente, la producción de embriones somáticos se divide en tres etapas: En la pri- mera, conocida como inducción, se induce el desarrollo de un tejido embriogénico. Sometidas a los estímulos adecuados, las células meristemáticas suelen dar dos tipos de respuestas: a)
se multiplican y generan una masa desorganizada de células que recibe el nombre de callo embriogénico (porque tiene capacidad potencial de generar embriones), o bien, b)se dividen para ormar directamente embriones. Cuando se obtiene callo embriogénico es necesario es- timular el desarrollo de los embriones. Durante la etapa de desarrollo, el callo embriogénico se transplanta a un nuevo medio de cultivo, donde se estimula a los cúmulos de células poten- cialmente embriogénicos para que experimenten un proceso completo de desarrollo y ormen embriones.
En ocasiones se somete a los embriones a un proceso de maduración. Durante este pro- ceso se almacenan en los cotiledones sustancias de reserva y el embrión pierde paulatina- mente humedad. La maduración de los embriones mejora la efciencia de germinación y es muy conveniente cuando los embriones no están destinados a producir de inmediato plantas completas, también hay semillas sintéticas que emplean otros propágulos: brotes (tallos con algunas hojas) o raíces, los cuales pueden generar después de uno o varios pasos de cultivo in vitro plantas completas. Pero la mayor parte de las veces, las plantas se generan directamente por germinación de embriones sin madurar. Como los requerimientos de cultivo de estas tres etapas son distintos, se ocupan en las dierentes etapas, medios de cultivo dierentes.
El principal modelo de estudio de la embriogénesis somática es la zanahoria. Esta posi- bilidad tecnológica se descubrió precisamente en esta especie. Steward, en 1958 y Reinert en 1959, observaron que las células de zanahoria crecidas en un cultivo de callos en suspensión, tenían la capacidad de ormar unidades estructurales discretas, con una orma de desarrollo similar a la que presentan los embriones cigóticos. Si estos embriones se ponían en condicio- nes adecuadas, germinaban y producían plantas completas. Ellos llamaron a estos propágulos embriones somáticos.
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Objetivo general
Obtener embriones somáticos de zanahoria.
Objetivos específcos
• Germinar semillas de zanahoria en condiciones estériles.
• Probar el eecto de dierentes concentraciones de 2,4-D sobre la inducción de callo embriogénico de zanahoria.
• Determinar cuál es el mejor explante para la inducción de callos embriogénicos de zanahoria.
• Probar el eecto de la concentración de sacarosa y la uente de nitrógeno en el desa- rrollo de embriones somáticos de zanahorias.
Material y equipo
Material Equipo
1 espátula estéril Autoclave 30 tapas para rascos Gerber Potenciómetro Pinzas largas estériles Balanza analítica
2 mecheros Incubadora de vegetales 2 mallas de acero inoxidable estériles Campana de ujo laminar *1 paquete de cajas Petri estériles
*12 rascos Gerber grandes de boca ancha (125 ml) Reactivos
*Mango para bisturí del no. 4 Medio MS
2, 4-D (2, 4 ácido dicloroenoxiacético) Alcohol etílico al 70%
*5 hojas para bisturí estériles del no. 21 o 22 Agar *Papel aluminio Sacarosa *Una caja de cartón L-glutamina *Un rollo de plástico Paraflm o Plastipack Cloro al 30%
HCl 1N Material biológico KOH 1N Semillas de zanahoria
*Material que deberán traer los alumnos
Metodología
Los experimentos se llevarán a cabo empleando el medio de cultivo básico ms (ver anexo), al
que se le agregarán distintas concentraciones de hormonas de crecimiento en los dierentes experimentos eectuados. En todos los casos se ajustará el pH del medio a 5.7 con HCl y KOH 1N y se esterilizará en autoclave durante 20 minutos a 120oC.
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El proceso de inducción de embriogénesis somática se eectuará en tres etapas: germina- ciónin vitrode semillas, inducción de callo embriogénico y embriogénesis.
PARTE I. Germinación de semillasin vitro Desinfección de semillas
1. Las semillas se colocan en una solución jabonosa ligera (una pizca de cualquier de- tergente) y se agitan durante un minuto para eliminar basura y polvo.
2. Se colocan en un colador de acero inoxidable y se enjuagan con agua corriente hasta que se elimine el detergente por completo.
3. Se bañan con alcohol al 70% para eliminar aceites, grasas y ceras
4. Se sumergen en una solución al 30% de hipoclorito de sodio (a partir de la solución comercial). Las semillas se mantienen en la solución de cloro durante 20 minutos en agitación constante.Es muy importante que las semillas no permanezcan más tiempo en la solución.
5. En la campana de ujo laminar, se remueve la solución con ayuda de un colador de acero inoxidable estéril.
6. Las semillas se enjuagan tres veces con agua destilada estéril.
7. Las semillas quedan listas para ser sembradas en el medio de cultivo.
Cultivo in vitro
Se emplearán rascos de 125 ml con 25 ml de medio de cultivo básicomssemisólido (ver anexo)
adicionado con 30 g de agar y 8 g de sacarosa.
1. El rasco se destapa y la tapa se coloca hacia arriba cerca del mechero
2. Con ayuda de las pinzas se colocan cinco semillas en cada rasco (cada equipo sem- brará cinco rascos).
Nota:Las pinzas, después de usarse, se colocan en un rasco con alcohol (al rasco que con- tiene alcohol se le pone un poco de algodón en el ondo para que no se conunda con los rascos de agua). Antes de volver a usar las pinzas, se amean y cuando el alcohol remanente se apaga, se sumergen en un rasco con agua destilada estéril para que se enríen.
3. Se toma la tapa con las pinzas, se pasa rápidamente por la ama y se tapa el rasco con las semillas.
4. Los bordes de las tapas se sellan usando un rollo de plástico (Paraflm o Plastipack). 5. Los rascos se mantendrán en una cámara de incubación a 25 °C en oto-periodo de
16 h luz/8 h oscuridad, bajo lámparas uorescentes.
6. Después de seis semanas de cultivo las plantas están listas para utilizarse como ex- plantes.
PARTE II. Inducción de callo embriogénico
1. Se probarán tres tratamientos para la inducción de callo embriogénico: Medio semi- sólidoms(ver anexo) con 1, 1.5 y 2 mg/L de 2,4-D.
2. En todos los casos se colocarán cinco explantes en caja Petri con 25 ml de medio. Se ocuparán porciones de tallos, raíces y hojas (de plantas germinadas in vitro de dos meses de edad) como explantes. Se harán cinco repeticiones por tratamiento.
3. Las cajas se mantendrán a 25 °C bajo condiciones de oscuridad (cada equipo probará uno de los tratamientos).
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4. La respuesta se evaluará después de cinco semanas de tratamiento por la presencia de callo embriogénico y la recuencia de respuesta. Los resultados de todos los equipos se reunirán y el reporte de la práctica se hará con el resultado de todos los experimentos.
PARTE III. Embriogénesis
1. Se probarán cuatro tratamientos para el desarrollo de embriones somáticos de zana- horia: Mediomscon 3% de sacarosa, mediomscon 6% de sacarosa, mediomscon 3%
de sacarosa y 750 mg/L de L-glutamina y medio mscon 6% de sacarosa y 750 mg/L
de L-glutamina (cada equipo probará uno de los tratamientos).
2. En cajas de Petri con 25 ml de medio nutritivo se colocarán cuatro porciones de callo (del mejor callo obtenido en la etapa de inducción, se harán tres repeticiones por tratamiento).
3. Las cajas se mantendrán en las condiciones antes descritas durante cuatro semanas, el resultado se evaluará por la presencia de embriones somáticos en estado cotile- donario. Los resultados de todos los equipos se reunirán y el reporte de la práctica se hará con el resultado de todos los experimentos.