2.2.3. Amastigotes
2.2.3.3. Infección de los macrófago
Los macrófagos en cultivo fueron separados por EDTA- PBS (etilendiamina tetra acético-fosfato- solución salina tamponada), y posteriormente, se procedió hacer el recuento con nigrosina en cámara de Neubauer. En una placa de 24 pocillos, se agregó 0.5 mL macrófagos a una concentración de 5 x 104 macrófagos / pocillo, 0.05 mL tripomastigotes a una concentración de 5 x 105 tripomastigotes sanguíneos/ mL y 1.45 mL de medio RPMI-1640, dando un volumen final de 2 mL; luego, se incubo a 37° C, en una cámara con 5% de CO2 durante 24h48, 49.
2.2.3.4. Ejecución del bioensayo Aplicación de EE y EA
Después de la infección del macrófago, el medio de cultivo fue removido para eliminar los parásitos restantes, y se añadió RPMI-1640 a cada pocillo, hasta un volumen de 2 mL; los EE y EA con concentraciones no tóxicas para macrófagos
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(concentración < CD50), fueron disueltos en DMSO al 1% y agua estéril, respectivamente,y se agregó 10 µL a los pocillos que contenían macrófagos infectados con T. cruzi; luego, se incubóa 37° C, en una cámara con 5% de CO2 durante 48 h48, 49 (Anexo 12).
Determinación de la viabilidad
Transcurrido el tiempo de incubación (48 h) de la placa, de cada pocillo se tomó una muestra para ser coloreada con Giemsa y determinar el número de amastigotes / 100 macrófagos (Anexo 13a y b). El porcentaje de la actividad anti-amastigotes (% AA) se expresó como:
% AA = [1 - (N º A/100 MØ) p / (N º A/100 MØ) c] * 100
Dónde: (N º A/100 MØ) p representa el número de amastigotes / 100 macrófagos que contienen diferentes dosis de extracto y (N º A/100 MØ)c representa el número de amastigotes / 100 macrófagos que no contienen extractos (control).
Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado y los resultados se expresaron como media ± desviación estándar48.
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2.2.4. Análisis de datos.
Los resultados obtenidos fueron sometidos al análisis de varianzas (ANOVA) y a una prueba de comparación de medias Tukey a fin de determinar las diferencias entre los grupos experimentales y control, mediante el uso de un programa computarizado SPSS vr. 20 con un grado de significancia de 0.05.
2.3. Consideraciones éticas:
Los ratones utilizados en la investigación fueron instalados en jaulas de metal en el Bioterio de Artropodología en donde se les brindó las condiciones adecuadas de alimentación, ventilación y temperatura; así mismo fueron anestesiados antes de cualquier procedimiento que les cause dolor o molestia.
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RESULTADOS
Al ser sometido epimastigote de Trypanosoma cruzi a diferentes concentraciones (10.0, 12.5 y 25.0 µg/mL) de extractos etanólico (EE) y acuoso (EA) de Acnistus arborescens,se logró a la concentración de 25µg/mL el 85% de inhibición de tripomastigotes en EA y el 95% en EE (Figura 1); encontrándose diferencia significativa (p< 0.05) entre los tratamientos y un R2 de 0.98 en EA y de 0.94 en EE (Figura 3).
En el ensayo in vitro de tripomastigotes de T. cruzi, a la concentración de 25 µg/mL se logró el 91% de inhibición de tripomastigotes en EA y el 99% en EE (Figura 2); encontrándose diferencia significativa (p< 0.05) entre los tratamientos y un R2 de 0.99 en EA y EE (Figura 4).
En la tabla 1 se reporta la media, desviación estándar y concentración inhibitoria del 50% (IC50) al exponer epimastigote y tripomastigote de T. cruzi a las concentraciones de 10.0, 12.5 y 25.0 µg/mL de EA y EE, obteniendo un CI50 de 9.8 y 13.8 µg/mL en EA y de 9.7 y 13.70 µg/mL en EE a las concentraciones de 10.0 y 25.0 0 µg/mL respectivamente, mientras que el CI50 obtenida para tripomastigote fue de 10.0 y 14.0 µg/mL en EA y de 10.0 y 14.0 µg/mL en EE a las concentraciones de 10.0 y 25.0 0 µg/mL respectivamente.
En la tabla 2 se reporta la media, desviación estándar y el porcentaje de la actividad anti- amastigotes (%A/A) al exponer amastigotes de T. cruzi a las concentraciones de 10.0 y 12.5 µg/mL de EA y EE, lográndose el 75 % de inhibición de amastigotes en el EE y el 68 % en el EA; encontrándose diferencia significativa (p< 0.05) entre los tratamientos.
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** F 11gl = 137.504 p < 0.05 * F 11gl = 262.171 p < 0.05
Figura 1. Porcentaje de inhibición in vitro de epimastigotes de Trypanosoma cruzi expuesto a las concentraciones de 10.0, 12.5 y 25.0 µg/Ml de los extractos etanólico y acuoso de Acnistus arborescens y grupo control.
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** F 11gl = 43.455 p < 0.05 * F 11gl = 14.726 p < 0.05
Figura 2. Porcentaje de inhibición in vitro de tripomastigotes de Trypanosoma cruzi expuesto a las concentraciones de 10.0, 12.5 y 25.0µg/mL delos extractos etanólico y acuoso de Acnistus arborescens y grupo control.
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* F 11gl = 262.171 p < 0.05 ** F 11gl = 137.504 p < 0.05
Figura 3. Análisis de regresión lineal del porcentaje de inhibición de epimastigotes de Trypanosoma cruzi vs. logaritmo de las concentraciones delos extractos acuoso y etanólico de Acnistus arborescens.
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* F 11gl= 14.726 p < 0.05 ** F 11gl= 43.455 p < 0.05
Figura 4. Análisis de regresión lineal del porcentaje de inhibición de tripomastigotes de Trypanosoma cruzi vs. logaritmo de las concentraciones de los extractos acuoso y etanólico de Acnistus arborescens.
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Tabla 1: Media y desviación estándar de las absorbancias, y concentración inhibitoria del 50% (IC50) al exponer epimastigote y tripomastigote de Trypanosoma cruzi a las concentraciones de 10.0, 12.5 y 25.0 µg/mL de los extractos acuoso (EA) y extracto etanólico (EE) de Acnistus arborescens.
Forma evolutiva Concentraciones (µg/mL)
Media ± desviación estándar de las
absorbancias IC50 (µg/mL) EA EE EA EE Epimastogote 10.0 0.200 ± 0.007 0.176 ± 0.019 9.8 9.7 12.5 0.146 ± 0.004 0.102 ± 0.020 11.1 11.5 25.0 0.053 ± 0.015 0.018 ± 0.017 13.8 13.7 control 0.348 ± 0.021 0.334 ± 0.023 - - Tripomastigote 10.0 0.037 ± 0.114 0.028 ± 0.006 10.0 10.0 12.5 0.029 ± 0.019 0.021 ± 0.005 11.1 11.1 25.0 0.007 ± 0.011 0.001 ± 0.010 14.0 14.0 control 0.079 ± 0.008 0.074 ± 0.010 - -
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** F 5gl = 37.290 p < 0.05 * F 5gl = 32.000 p < 0.05
Figura 5. Porcentaje de citotoxicidad in vitro de macrófagos expuesto a las concentraciones de 10.0, 12.5 y 25.0 µg/mL delos extractos etanólico y acuoso de Acnistus arborescens.
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Tabla 2: Media y desviación estándar de las absorbancias, y el porcentaje de la actividad anti-amastigotes (%A/A) al exponer amastigotes de Trypanosoma cruzi a las concentraciones de 10.0 y 12.5 µg/mL de extracto acuoso (EA) y extracto etanólico (EE) de Acnistus arborescens.
Concentraciones (µg/mL)
Media ± desviación estándar delas
absorbancias % AA EA EE EA EE 10.0 36 ± 2.6 30 ± 1.0 56 63 12.5 26 ± 2.1 19 ± 3.1 68 78 control 78 ± 3.6 78 ± 3.6 - -
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Y COMUNICACIÓN
DISCUSIÓN
Acnistus arborescens, es una arbusto utilizado tradicionalmente en diversos departamentos del Perú, siendo consumida por algunos pobladores como antiparasitario y usada para el tratamiento de contusiones, torceduras o esguinces24,26,27, si bien esta especie es conocida por sus propiedades medicinales; en la actualidad en el Perú no se dispone de datos fiables sobre su farmacología, por tal motivo surge la necesidad de investigar las propiedades que se le atribuyen, por lo que en este trabajo se trató de comprobar su efecto antiparasitario.
Los resultados obtenidos en el presente trabajo sobre el efecto de diferentes concentraciones de los extractos etanólico (EE) y acuoso (EA) de A. arborescens (Fam. Solanaceae) sobre la viabilidad in vitro de Trypanosoma cruzi indicaría que dicha planta presenta propiedades tripanocidas (Figura 1 y 2, Tabla 2). Al encontrarse diferencia significativa (p< 0.05) entre los tratamientos del ensayo in vitro de epimastigotes de T. cruzi expuestos a las concentraciones de 10.0, 12.5 y 25.0 µg/mL de los EE y EA, en el cual se logró el 95% de inhibición de epimastigotes a la concentración de 25.0 µg/mL de EE y el 85% a la concentración de 25.0 µg/mL de EA; en cuanto al ensayo in vitro de tripomastigotes de T. cruzi se encontró también diferencia significativa (p< 0.05) entre los tratamientos con las concentraciones de los EE y EA , lográndose el 99% de inhibición a la concentración de 25.0 µg/mL de EE y el 91% a la concentración de 25.0 µg/mL de EA. (Figura 2).
El efecto tripanocida de los EE y EA de A. arborescens se podría atribuir a la presencia de principios activos con actividad antiparasitaria como esteroides, terpenos,
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flavonoides y withanolidos; dichos fitoconstituyentes han sido reportados por Morantes et al51 al realizar el estudio sobre la actividad citotóxica y análisis fitoquímico de fracciones aisladas del extracto etanólico total de A. arborescens; asimismo Nagafuji et al33, atribuyen a los witanólidos de Physalis angulata como responsables de la actividad tripanocida contra las formas tripomastigote y epimastigote de T. cruzi, ademásLeite et al23, aislaron triterpenos del extracto etanólico de la hoja de Arrabidaea triplinervia, a los cuales les atribuyen la actividad tripanocida contra epimastigote.
La diferencia entre el efecto del EE y EA de A. arborescens probablemente se debería a que el EE presenta una mayor cantidad de principios activos con efecto parasitario, por ser el alcohol 70° menos polar que el agua, por lo que habría permitido la extracción de terpenos, esteroide, flavonoides y withanólidos32,51, es así que los flavonoides actuarían inhibiendo la enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GADPH) por lo tanto la principal vía de producción de ATP en el parásito52-53, asimismo los withanólidos y los esteroles también actúan inhibiendo la vía de producción de ATP, alterando la morfología de la mitocondria y el glicosoma del parásito32,33; esto haría que el EE tenga mejor efecto que el acuoso debido a que estos principios activos se complementan para dar un mayor porcentaje de inhibición del parásito.
Por otro parte, a pesar que el agua es mejor disolvente debido a su polaridad, tiene la desventaja de extraer y arrastrar grandes cantidades de sustancias no aprovechables, por tal motivo el EA presentaría poca cantidad de principios activos con actividad tripanocida, obteniéndose solo con este disolvente terpenos, esteroles y algunos withanolidos51, esto explicaría que a pesar que ambos extractos tienen la misma concentración los resultados
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son diferentes (figura 1 y 2, tabla 2), esto concuerda con el trabajo realizado por Sunday et al21, quienes demostraron que los extractos metanólicos y acuosos de las hojas y de la corteza del tallo de Prosopis africana presentan actividad tripanocida in vitro, siendo el extracto metanólico el que presenta mayor actividad tripanocida.
Así mismo, se evaluó como control de viabilidad los disolventes del EE y EA, obteniendo que el dimetil sulfóxido (DMSO), empleado como disolvente para el EE y el agua estéril, utilizada como disolvente para el EA, no mostraron actividad contra T. cruzi (Anexo 6b y c, 8b y c); lo que indicaría que estos disolvente no interfiere en la actividad de los extractos evaluados, esto coincide con el trabajo realizado por Rojas et al22, quienes evaluaron in vitro la actividad anti T. cruzi de diez aceites de plantas medicinales, usando como control de viabilidad DMSO al 1%, el cual no presentó actividad contra T.cruzi.
En el ensayo in vitro de la citotoxicidad de macrófagos frente a las concentraciones de EE y EA, se obtuvo que a la concentración de 25.0 µg/mL de EE y EA, el porcentaje de citotoxicidad es mayor en un 50% (Figura 5), superando así el valor máximo sugerido para la selección de productos con posible actividad tripanocida en este tipo de valoración in vitro49,51; en base a los resultados obtenidos en el ensayo in vitro de citotoxicidad de macrófagos, se realizó el ensayo in vitro de viabilidad de amastigotes con las concentraciones de EE y EA no citotóxicas para macrófagos, lográndose el 75% de inhibición de amastigotes a la concentración de 12.5 µg/mL del EE y el 68% a la concentración de 12.5 µg/mL de EA (Tabla 2).
Durante el proceso de infección, las formas de amastigote de T. cruzi se localizan en el citoplasma de las células huésped, donde los niveles de glucosa libre son muy bajos; por
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lo tanto, los amastigotes recurren al catabolismo de los aminoácidos aromáticos como fuente de energía y carbón, pero para catabolizar los aminoácidos requiere de una fuente de electrones que sería brindado por el succinato, el cual se forma de la fermentación aeróbica de la glucosa, por lo que los amastigotes tienen glicosomas con una alta act ividad de enzimas glicoliticas54-56; una enzima glicolitica importante en este proceso de degradación de glucosa es la GADPH la cual es inhibida por flavonoides presentes en el EE, por lo cual probablemente se deba la diferencia de porcentajes de inhibición de amastigotes del EE y EA.
Así mismo, los flavonoides tienen la propiedad de disminuir la actividad de la enzima arginasa, enzima importante sobre las vías de activación de macrófagos; la enzima arginasa al ser inducida por el antígeno cruzipaina de T. cruzi activa a los macrófagos por la via alterna fallando en la producción de óxido nítrico (NO) a partir de L-arginina, permitiendo la proliferación del parásito en los macrófagos; pero al ser inhibida esta enzima por los flavonoides, los macrófagos se activarían por la via clásica actuando el óxido nítrico sintetasa inducible sobre la L- arginina produciendo NO, el cual es una molécula efectora citotóxica del sistema inmune53,57,58.Por otra parte, el medio RPMI-1640 utilizado en el ensayo in vitro de amastigotes de T. cruzi está compuesto por aminoácidos, sales inorgánicas, vitaminas y glucosa59, lo que permite las condicione apropiadas para evaluar la viabilidad in vitro de la forma amastigote de T. cruzi.
Los resultados obtenidos en el presente trabajo constituyen una alternativa a seguir siendo evaluada, dado queA. arborescens es un recurso natural asequible por los pobladores, sería importante su incorporación dentro de las plantas medicinales que utilizan
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en el tratamiento de T. cruzi; además podría servir como base para la síntesis de nuevas drogas que ayuden a aliviar esta enfermedad. Por lo que los extractos etanólico y acuoso de A. arborescens se presenta como una promisoria posibilidad que debe continuar estudiándose, debido a que afecta el proceso de las formas evolutivas de T. cruzi.
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CONCLUSIONES
Las concentraciones mayores a 12.5 µg/mL de extracto etanólico y acuoso de Acnistus arborescens disminuye la viabilidad in vitro de epimastigotes de Trypanosoma cruzi en más del 50%.
Las concentraciones mayores a 10.0 µg/mL de extracto etanólico y acuoso de A. arborescens disminuye la viabilidad in vitro de tripomastigotes de T. cruzi en más del 50%.
Las concentraciones de 10.0 y 12.5 µg/mL de extracto etanólico y acuoso de A. arborescens disminuye la viabilidad in vitro de amastigotes de T. cruzi en más del 50%.
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