I. 2.1.2 Galactosidasa de Bacillus circulans: Biolacta No 5 (Daiwa kasei)
I.3. Glicosidasas en disolventes sostenibles
I.3.5. Influencia de los disolventes sostenibles en la estructura terciaria de las
estructura terciaria de las enzimas
Los disolventes pueden ejercer numerosos efectos sobre las enzimas, que en muchos casos no son fáciles de dilucidar. El entorno químico de una enzima y en particular su centro activo, durante una reacción química, es muy complejo. Existen iones (en caso de que se use un medio tamponado), sustratos y disolventes, valores de pH y temperaturas, que afectan las interacciones entre las distintas partes de la reacción. Dada la complejidad del sistema, pueden darse interacciones tales como: enzima- disolvente, enzima-sustrato, sustrato-sustrato, sustrato-disolvente. Por ello resulta difícil comprender la globalidad de factores que determinan el resultado final de una reacción enzimática. En la actualidad, existen distintas herramientas tecnológicas que permiten medir en condiciones bastante sensibles y exactas, algunas de las interacciones que pueden darse durante una determinada reacción química.
En el caso de las reacciones enzimáticas, se requiere desarrollar sistemas de alta sensibilidad y bajo consumo de muestra. Dentro de las diferentes técnicas existentes para estudiar la influencia de los disolventes orgánicos (sostenibles o no) en la estructura tridimensional de una enzima, podemos destacar dos de ellas, la espectroscopía de fluorescencia y las técnicas bioinformáticas. La espectroscopía de fluorescencia es una herramienta útil para detectar cambios estructurales de las proteínas debido a la presencia de disolventes orgánicos en el medio de reacción. La bioinformática, a través del modelado molecular y el “docking”, permite predecir, interpretar o explicar las posibles interacciones en ambientes microscópicos. 329-332
En el presente trabajo se utilizarán la espectroscopía de fluorescencia como herramienta para el análisis de los resultados obtenidos.
I.3.5.1.Espectroscopia de Fluorescencia
La fluorescencia es el resultado de la emisión de luz fotoinducida por un grupo fluoróforo. Este fenómeno requiere de una excitación previa, por medio de una radiación incidente a una determinada longitud de onda, que provoca la excitación de los electrones a un nivel energético excitado de la molécula (singlete excitado). La relajación de este estado provoca la emisión de luz con un máximo de emisión en una longitud de onda mayor que la inicial.333-334 Este fenómeno está asociado a la presencia de fluoróforos que son estructuras rígidas y conjugadas que estabilizan el estado excitado. En el caso de las proteínas, la emisión de fluorescencia está directamente relacionada con la presencia del triptófano (anillo rígido conjugado) y en menor medida de la tirosina y de la fenilalanina.335 Una alta presencia de triptófanos en la proteína garantizará un espectro de emisión intenso y fácil de medir, incluso en equipos de baja sensibilidad.
Los cambios en el micro-entorno químico de un triptófano modifican la estructura del complejo excitado y con ello la longitud de onda de emisión y consecuentemente los valores de longitud de onda en los que se obtienen los máximos de fluorescencia. Esta información permite obtener datos sobre la estructura terciaria de una proteína y permite medir el efecto de factores externos como el pH o agentes químicos sobre su estructura terciaria (particularmente el entorno de los triptófanos), ya que la presencia de sustancias que afectan la estructura de la proteína repercutirá directamente en su espectro de fluorescencia. 335-336
I.3.5.2.Herramientas de Bioinformática
Las simulaciones por ordenador han probado ser herramientas eficaces para entender las estructuras de las proteínas y sus dinámicas con el medio. 337-339 Existen varios programas informáticos, bases de datos y servidores que ofrecen numerosas herramientas para analizar y predecir características estructurales de las proteínas como por ejemplo: punto isoeléctrico, puentes disulfuro, plegamientos, etc. Estas
predicciones se realizan en su mayoría basándose en algoritmos creados por homología con información de proteínas previamente caracterizadas.
Bases de datos
En los últimos años las bases de datos reúnen la información de genes y proteínas de numerosos organismos, así también ofrecen importantes herramientas de comparación entre la secuencias de un gen o proteína, lo que ha facilitado el acceso a este tipo de información a nivel mundial. Dentro de las bases de datos de mayor importancia para el análisis de proteínas se pueden citar las siguientes:
NCBI: El NCBI es la base de datos del “Nacional Center for Biotechnology Information” de los Estados Unidos de América. Su dirección web es la siguiente: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Esta es una base de datos con múltiples funciones, ofreciendo: base de datos de literatura (PubMed, especializada en biomedicina), nucleótidos, herramientas para análisis de secuencia (GenBank) y herramientas para el diseño de estructuras tridimensionales, entre otras. De ellas, una de las más utilizadas para el análisis comparativo de proteínas es el alineamiento de secuencias proteicas por medio de la herramienta “BLAST” (“Basic Local Alignment Search Tool”),340 la que permite obtener valores porcentuales de identidad entre dos ó más proteínas.
Protein Data Bank (PDB): El PDB, 341 es una base de datos online del “Research
Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB)” de los Estados Unidos de América, que acepta el depósito de estructuras tridimensionales de proteínas. Su dirección web es la siguiente: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do
Las macromoléculas disponibles en esta base de datos pueden encontrarse aisladas o bien en forma de complejos: proteína-proteína, proteína-ácido nucléico y macromolécula-ligandos. Los modelos depositados provienen fundamentalmente de
difracción de rayos-X y algunos de espectroscopía de RMN. A cada una de las entradas se les asigna un código de identificación formado por 4 caracteres denominado “PDB ID”.
ExPASy (Expert Protein Analysis System): Esta es una herramienta online del “Swiss Institute of Bioinformatics” que permite determinar características de una determinada enzima a partir de su secuencia de aminoácidos en formato “Fasta(Fast
Alignment)”.342 Su dirección web es la siguiente: http://web.expasy.org/
Las herramientas más populares en la predicción de propiedades de proteínas son “ProtParam” 343 y “SWISSPROT”. 344 En la primera de ellas se obtienen varios parámetros estimados a partir de una secuencia escrita en formato FASTA, 342 tales parámetros son: peso molecular, punto isoeléctrico teórico, composición de aminoácidos, composición atómica, coeficiente de extinción molar, vida media estimada, índice de inestabilidad, índice alifático y promedio de hidrofobicidad. En la segunda de ellas se indexan todas las proteínas secuenciadas y contiene múltiples referencias a otras bases de datos.
CAZy: Para el presente trabajo, CAZy (“Carbohydrate Active Enzymes”) 345 es una
base de datos de gran utilidad, ya que ofrece información especializada en visualización y análisis de información genómica, estructural y bioquímica en enzimas activas sobre carbohidratos. La página ha sido desarrollada por el grupo de glicogenómica en arquitectura y función de las macromoléculas Biológicas de la Universidad del Mediterráneo en Provenza, Francia. Su dirección web es la siguiente: http://www.cazy.org/
La base de datos CAZy inició como página web en 1998 y en ella se describe las familias de los módulos catalíticos estructuralmente relacionados y los hidratos de carbono vinculados (o dominios funcionales) de las enzimas que degradan, modifican o crean enlaces glucosídicos.