Inmunofluorescencias

Se cultivaron 1,3x105 _{células PC3 y C42B sobre cubreobjetos de 12 mm de diámetro cubiertos} con FNC Coating Mix (EE.UU.) para simular una matriz celular. El FNC Coating Mix fue colocado sobre los vidrios, previo al plaqueo de células, durante 10 min. Posteriormente fueron lavados dos veces con PBS 1x estéril y colocados en placas de 12 pocillos. Luego, se procedió a los respectivos tratamientos y transfecciones. Las células fueron lavadas suavemente con PBS y luego fijadas con una solución 4% m/v de paraformaldehído (PFA), 4% m/v de sacarosa y 0,1% v/v glutaraldehido durante 20 min. a temperatura ambiente. Luego de remover la solución fijadora y realizar 3 lavados con PBS, las células se incubaron en una solución permeabilizadora de PBS-tritón 0,05% v/v durante 20 min. Este paso fue obviado en el análisis de distancia al primer vecino, donde las células fueron marcadas con una sonda de membrana, C-laurdan. Nuevamente, las células fueron lavadas con PBS y se agregó glicina

100 mM. Posteriormente, los vidrios fueron colocados en una cámara húmeda y oscura sobre

Parafilm y se realizó un bloqueo con PBS-BSA 3% m/v. Para las tinciones que incluyen

rodamina- faloidina, el bloqueo se realizó ON, mientras que para las marcaciones de E- cahderina y b-catenina, el bloqueo fue de 1 h. Los vidrios fueron lavados con PBS e incubados con la sonda o anticuerpo primario correspondiente:

i) Para las tinciones con E-cadherina y b-catenina se preparó una dilución 1:200 de cada anticuerpo, preparados en PBS-BSA 3% m/v. Los vidrios fueron incubados ON a 4 h con los anticuerpos primarios. Al día siguiente, se los incubó con anticuerpo secundario Alexa Fluor 488 o Alexa Fluor 555, respectivamente, en una dilución 1:5000, preparada en PBS-seroalbúmina bovina (BSA) 3% m/v.

ii) para las tinciones con rodamina-faloidina, se preparó una dilución 1:500 de Rodamina Faloidina en etanol 96% v/v y luego, a partir de ésta, se preparó una dilución 1:10 en PBS-BSA 3% m/v. La rodamina-faloidina se incubó durante 1 h a 4º C.

iii) para la tinción con C-laurdan se utilizó dicha sonda en una concentración 5 µM preparada en PBS-BSA 3% m/v, incubada durante 1 h a 4º C.

iv) para las tinciones con rodamina- faloidina y anticuerpos anti-HO-1 o anti-MMP9, luego de incubar con rodamina-faloidina, las células se lavaron con PBS y se incubaron 2 h a 4º C con el respectivo anticuerpo. Ambos anticuerpos primarios fueron preparados en PBS-BSA 3% m/v en una dilución 1:100. Posteriormente, se procedió a incubar con el anticuerpo secundario acoplado a fluoróforo en una dilución 1:6000 en la misma solución de bloqueo durante 1 h a 4º C. Para STORM se utilizó un anticuerpo primario anti-a-tubilina en una dilución 1:2000 y una dilución del anticuerpo secundario 1:1000.

Finalmente, luego de lavar los vidrios con PBS, los mismos fueron montados en un portaobjetos con 2 µl de Mowiol 488 (Sigma-Aldrich, EE.UU.) y guardados a 4º C en oscuridad hasta su uso.

Las imágenes correspondientes a E-cadherina, b-catenina, F-actina, MMP9 y HO-1 fueron obtenidas por microscopía confocal utilizando un microscopio Olympus Fluoview FV1000, con un objetivo UPlanSApo 60X de inmersión en aceite con una apertura numérica NA 1/41.35 Olympus, utilizando un láser diodo 543, 488 y 635 como las fuentes de excitación.

Las imágenes correspondientes a la distancia al primer vecino fueron obtenidas por microscopía de fluorescencia utilizando un microscopio invertido de epifluorescencia Olympus IX7, con un objetivo UPlanSApo 10X de inmersión en aceite, con una apertura numérica NA 0,30 Olympus. Las fotografías fueron obtenidas con una cámara Qimaging EXI Aqua. Las imágenes fueron analizadas con un algoritmo diseñado para binarizar la imagen y asignar una etiqueta a cada conjunto de pixeles conectados, que representa una única célula o bien un conjunto de células en el cual no puede distinguirse cada célula individual. Para cada conjunto de células, se calculó la distancia a la primera célula vecina. Las distancias fueron normalizadas al radio celular promedio.

Para cuantificar los filopodios, seleccionamos regiones en las cuales los filopodios de células vecinas estuviesen en contacto, (excluyendo zonas de contacto directo entre membranas) y dividimos estas regiones en segmentos donde la distancia entre las células, permanecieran constante. Posteriormente, utilizando el programa Matlab, analizamos los perfiles de intensidades con un algoritmo que suaviza los picos de señal obtenidos y extrae las posiciones de los máximos de intensidad correspondientes a filopodios, para luego establecer la densidad de contactos sobre el perfil trazado148_.

La mecánica de los microtúbulos fue evaluada por microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM, por sus siglas en inglés). Se determinó la longitud de persistencia (Lp) de los microtúbulos mediante la técnica de microscopía de acuerdo a la metodología previamente descripta. Brevemente, Gittes y colaboradores149 _{establecieron un método que} nos permite analizar los filamentos (en este caso, microtúbulos) como si fuesen funciones trigonométricas, y así establecer diferencias en la curvatura (amplitud) de los mismos. Como muestra la Figura 21, las posiciones XY de los microtúbulos fueron reconstruidas una rutina de seguimiento de filamentos de acuerdo al procedimiento descripto por Pallavicini y colaboradores148_.

Figura 21. Esquematización del fundamento de la técnica de STORM e imágenes representativas de microtúbulos obtenidas por microscopía wide field vs. STORM. Adaptación150

Se realizó un análisis de Fourier sobre la forma de los filamentos y se registraron las amplitudes de los mismos, fraccionando cada filamento en segmentos de 3 µm. Finalmente, la Lp fue obtenida ajustando al inverso del cuadrado del conjunto de varianzas de estas amplitudes como función del número de modo de acuerdo a la ecuación (2).

(2)

Donde qn = nπ/L es el vector de onda para un filamento de longitud L
. Este método ha resultado robusto para determinar la longitud de persistencia de microtúbulos y filamentos de actina in

vitro149_.